论文摘要
研究背景:胃癌和食管癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率高,预后差,严重危害人类健康。目前对于胃癌和食管癌的防治研究还未取得令人满意的结果,早期诊断是决定预后的关键。迄今为止,其诊断依然以影像学、内镜、病理组织学为主要诊断方法,其中内镜检查结合病理检查是发现早期胃癌和食管癌最有效的方法。但临床实践中,普通内镜检查不易发现早期肿瘤,随机活检的阳性率低,增加活检标本量既增加并发症风险,降低患者依从性,又加大病理医师的工作量,加重患者的经济负担。因此,能够早期发现消化道肿瘤、能够指导内镜活检的新型内镜及内镜新技术不断涌现。放大内镜、色素内镜是新型内镜的典型代表。放大内镜可将内镜图像放大15～300倍,色素内镜是在普通内镜检查过程中在病变黏膜上喷洒染料,使染色后病灶与正常黏膜组织之间有良好的对比性。放大内镜联合应用色素内镜能够观察到消化道黏膜表面的微小结构形态的改变,例如胃黏膜的胃小凹形态,对病变性质的判断极有帮助。除了黏膜表面的微小结构如胃小凹和上皮细胞外,肿瘤部位微血管形态的改变对于判断癌前病变的恶性倾向和肿瘤的恶性程度也起重要的作用。肿瘤新生血管形成导致的微血管密度和微血管形态的改变在早期胃肠道肿瘤及上皮内瘤变的诊断及判断预后中起重要作用。肿瘤血管生成是指在原有组织血管结构基础上形成新血管结构的过程。肿瘤血管有一生长缓慢到迅速增长的转折点,即肿瘤血管生成开关,确定肿瘤血管生成开关位点给予干预治疗,对于抑制肿瘤的生长和转移极为有益。有研究表明在结肠癌、Barrett’s食管相关腺癌等多种肿瘤中,血管生成开关位于癌前病变阶段,然而胃癌血管生成开关的部位尚未明确。评价肿瘤血管生成有多项指标,其中最常用的是测定微血管密度（MVD）,传统判断微血管密度的方法是石蜡或冰冻标本应用血管内皮标志物CD34、CD31、Ⅷ因子等免疫组织化学染色计数微血管数目。由于受标本处理过程中脱水等步骤的影响,标本中微血管形态、直径等均不能反应在体的状态。消化医师希望可以在内镜检查的过程中观察到黏膜微血管网,实时评价血管生成状态。放大内镜和窄带光照内镜（NBI）在一定程度上发挥了这一作用,然而在胃镜下观察黏膜能像在显微镜下一样清晰地显示微血管特征的新型内镜的临床应用仍是内镜医师的梦想。共聚焦激光显微内镜的研发成功使这一梦想得以实现。它是在普通内镜的末端加上一个极小的激光共聚焦显微镜,可达1000倍的放大效果,最大优点在于内镜检查同时无需进行活检和组织病理学检查即可获取活体粘膜表面及表面下结构的组织学图像,尤其是在体实时观察微血管形态,被誉为“光学活检”。然而由于共聚焦图像为灰阶图像,而且是对黏膜横断面扫描,所以共聚焦激光显微内镜的临床应用迫切需要进行共聚焦图像的识别,分析正常黏膜和癌黏膜间共聚焦图像的差异,建立对不同黏膜病变的诊断参数,以评价其临床应用价值。本研究旨在描述正常食管黏膜和胃黏膜各部位共聚焦图像微血管特征,并将共聚焦图像与相应的组织学图像对比,以评价共聚焦激光显微内镜进行实时模拟组织学检查的可行性;再分析正常食管胃黏膜与食管癌胃癌黏膜共聚焦图像微血管特征的差异,确定共聚焦图像诊断早期胃癌、浅表食管癌的微血管参数,评价依据以上参数诊断早期胃癌、浅表食管癌的临床价值;最后比较病变组织中CD34、CD105标记的MVD的差异,确定胃癌血管生成开关的可能位点;并比较共聚焦图像与相应部位组织中MVD、VEGF免疫组化染色的相关性,分析共聚焦激光显微内镜体内实时评价肿瘤血管生成的可行性。研究目的:1.描述正常食管黏膜和胃黏膜各部位共聚焦图像中微血管网的特点,将共聚焦激光显微内镜靶向活检取得的正常胃食管黏膜组织学图像与共聚焦图像进行对比,以评价共聚焦激光显微内镜进行实时模拟组织学检查的可行性;2.研发共聚焦图像分析软件,对图像中微血管参数进行分析,测量共聚焦图像中微血管管径、面积等,并对测量结果进行统计学分析;3.分析正常食管鳞状上皮及浅表食管鳞癌共聚焦图像细胞及微血管特征的差异,确定诊断浅表食管鳞癌的共聚焦图像参数,评价共聚焦激光显微内镜诊断食管浅表鳞癌的临床价值;4.分析早期胃癌和上皮内瘤变黏膜共聚焦图像微血管特征,与正常胃黏膜部位微血管形态进行对比,确定诊断早期胃癌和上皮内瘤变的微血管参数,评价共聚焦图像微血管形态改变诊断早期胃癌及上皮内瘤变的价值;5.研究正常胃黏膜—低级别上皮内瘤变—高级别上皮内瘤变—早期胃癌序列共聚焦图像微血管数目、管径的变化与相应组织免疫组化CD34和CD105标记的微血管密度（MVD）、VEGF表达的关系,探讨共聚焦激光显微内镜体内实时评价肿瘤血管生成的可能性,确定胃癌血管生成开关发生的可能部位,为临床早期及时合理进行抗肿瘤血管生成治疗提供新的依据。研究方法:1.2006年7月至2006年9月间就诊于山东大学齐鲁医院,因体检就诊或胃息肉摘除后随诊,内镜检查胃黏膜和食管黏膜均无异常的32例患者纳入研究,进行共聚焦激光显微内镜检查。所有患者检查食管黏膜、食管胃交界处黏膜、胃体黏膜和胃窦黏膜各一个部位。收集和保存检查部位有微血管形态的共聚焦图像,同时进行靶向活检。分析各部位共聚焦图像微血管形态的特点,同时共聚焦图像与相应部位黏膜组织学图像进行对比。2.将2006年7月至2007年6月在山东大学齐鲁医院胃镜室就诊,普通内镜或放大内镜诊断并经病理证实的食管浅表鳞癌患者纳入研究为鳞癌组,取无症状查体并且内镜检查食管黏膜无异常者为正常对照组。所有患者进行共聚焦激光显微内镜检查,保存共聚焦图像并靶向活检。比较浅表鳞癌组及对照组共聚焦图像中鳞状上皮细胞特征、鳞状上皮微血管即上皮乳头内毛细血管襻（IPCLs）的特征。同时对共聚焦图像质量和观察者间一致性进行评价。3.将2006年7月至2007年12月在山东大学齐鲁医院胃镜室就诊,普通内镜或放大内镜诊断并经病理证实的早期胃癌纳入研究。每例病人癌粘膜及癌旁5cm非癌粘膜各2个部位给予共聚焦激光显微内镜检查,对共聚焦图像微血管特征,包括形态、管径、数目、面积、微血管渗漏现象等进行分析。共聚焦激光显微内镜检查之后进行靶向活检,活检组织进行H&E染色,将共聚焦内镜下微血管形态与病理组织学诊断对比,分析不同病理黏膜的共聚焦图像微血管特征。4.将上一研究中的23个分化型胃癌部位,16个未分化型胃癌部位,并随机抽取20个高级别上皮内瘤变部位、20个低级别上皮内瘤变部位和10个正常胃黏膜部位纳入第四部分研究。收集各部位的共聚焦图像,并将靶向活检取得的组织进行CD34、CD105和VEGF免疫组化染色检查。记录共聚焦图像中微血管管径和数目,比较共聚焦图像中微血管特征和相应组织MVD-CD34、MVD-CD105、VEGF表达间的相关性。研究结果:1.在共聚焦激光显微内镜体内实时正常胃食管黏膜微血管成像的研究中,所有32例患者均在荧光素钠注射10～20秒后出现食管胃粘膜变黄,可进行共聚焦激光显微内镜检查并收集图像,平均检查持续时间为25分钟。食管鳞状上皮32个部位中有11个部位可观察到食管下段栅栏状血管网图像,栅栏状血管粗细不等,走行自然,边界清晰,共聚焦内镜下呈分支状或网状。上皮乳头内毛细血管襻向食管腔表面突出,呈短棒状,每个共聚焦图像上可见3～8个。在食管胃交界处食管侧鳞状上皮中有时可见单个腺体,上皮乳头内毛细血管襻（IPCLs）围绕在腺体周围,交界处IPCLs数目有所增加。在食管胃交界处柱状上皮侧微血管规则弯曲呈波浪样围绕在胃小凹开口周围,在交界线处微血管突然中断。胃体部位黏膜微血管呈蜂窝状或网状在胃小凹开口周围规则排列,而胃窦部位黏膜内微血管呈线圈样,沿胃小凹开口周围规则排列。以上各部位共聚焦图像与靶向活检组织学图像对应性好。2.在共聚焦激光显微内镜诊断浅表食管鳞癌的临床研究中,共有38例患者（18例浅表鳞癌,20例正常对照）的129个部位（69个鳞癌部位,60个正常部位）进行共聚焦内镜检查。共聚焦内镜图像与HE图像对应性好。在浅表食管鳞癌组,不规则排列的鳞状上皮细胞、上皮乳头内毛细血管襻（IPCLs）直径增加、IPCLs形态异常率显著增加。在对IPCLs形态异常部位的研究中,血管扭曲呈团块状的IPCLs、长分枝状的IPCLs在食管浅表鳞癌组明显增加。在所有的共聚焦图像中34%的图像质量评价为优。观察者间一致性评价为一般。3.在共聚焦激光显微内镜微血管成像诊断早期胃癌及上皮内瘤变的临床研究中,共有61例患者的239个部位进行共聚焦激光显微内镜检查并对其图像进行评价。病理组织学为分化型早期胃癌的23个部位中69.6%为Ⅰ型微血管形态,未分化型早期胃癌16个部位中75.0%为Ⅱ型微血管形态,高级别上皮内瘤变31个部位中80.6%为Ⅲ型微血管形态,低级别上皮内瘤变47个部位中34.0%和48.9%分别为Ⅳ型和Ⅴ型微血管形态,正常胃体黏膜中95.1%Ⅳ型微血管形态,正常胃窦黏膜中98.4%的部位为Ⅴ型微血管形态。分化型胃癌、未分化型胃癌和高级别上皮内瘤变组微血管管径显著高于低级别上皮内瘤变和正常胃体胃窦黏膜,分化型胃癌、高级别上皮内瘤变微血管数目显著高于正常胃体胃窦黏膜,分化型胃癌微血管面积显著高于未分化型胃癌,但与正常胃体胃窦黏膜无显著差异。早期胃癌组出现微血管渗漏现象的阳性率明显高于上皮内瘤变组和正常胃黏膜组。观察者间一致性评价为较好。4.分化型胃癌组、高级别上皮内瘤变组MVD-CD34计数明显高于未分化型胃癌组、低级别上皮内瘤变组和正常胃黏膜组;分化型胃癌组、低分化胃癌组、高级别上皮内瘤变组MVD-CD105计数及VEGF表达明显高于低级别上皮内瘤变组和正常胃黏膜组。共聚焦图像中微血管数目与MVD-CD34相关性较好（r=0.74）,与MVD-CD105亦有相关性（r=0.61）。VEGF阳性部位的共聚焦图像微血管管径明显高于VEGF染色阴性部位。研究结论:1.共聚焦激光显微内镜可对食管胃黏膜不同部位微血管清晰成像,显示食管黏膜和胃黏膜微血管呈现不同形态。共聚焦图像与组织学图像对应性好,靶向活检具有临床可行性。2.共聚焦图像中正常食管黏膜和浅表鳞癌黏膜有不同的鳞状上皮细胞和IPCLs特征,共聚焦激光显微内镜可区别食管正常黏膜和癌黏膜,应用这一新技术可望在内镜检查中早期发现食管鳞癌。3.正常胃黏膜和癌变黏膜共聚焦图像中微血管形态、管径、数目、面积和微血管渗漏阳性率显著不同,依据其改变可预测不同组织类型的早期胃癌及上皮内瘤变;微血管形态五型分类法对鉴别癌性黏膜和正常黏膜有良好的临床应用价值。4.在共聚焦图像微血管特征中,微血管形态、管径、数目是有价值的诊断参数,可用于诊断早期食管癌和早期胃癌。5.共聚焦图像与相应部位组织中CD34、CD105标记的MVD以及VEGF免疫组化染色图像相关性好,共聚焦激光显微内镜体内观察肿瘤血管生成具有可行性,为临床是否进行抗肿瘤血管生成治疗寻找到了可靠的依据;胃黏膜肿瘤血管生成开关可能发生于高级别上皮内瘤变阶段。研究意义:1.本研究集中描述了正常食管黏膜、正常胃黏膜、浅表食管鳞癌、早期胃癌及上皮内瘤变的共聚焦图像微血管特征;2.本研究通过系统分析正常黏膜和癌变黏膜共聚焦图像微血管特征差异,确定了微血管形态、管径、数目、面积及微血管渗漏现象等共聚焦激光显微内镜的微血管特征诊断参数,评价了依据以上参数诊断食管胃早期肿瘤的临床价值;3.设计了共聚焦图像分析软件,测量共聚焦图像上微血管直径、面积等参数,从而提高共聚焦内镜的临床实用性和便利性;4.提出了胃黏膜肿瘤血管生成开关可能发生的部位位于高级别上皮内瘤变阶段;5.评价了共聚焦激光显微内镜体内实时观察肿瘤血管生成的可行性,从而为临床是否进行抗肿瘤血管生成治疗寻找到了可靠的依据。
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