HMW-Glu（1Dx5、1Dy10）亚基基因在大肠杆菌中的融合表达

论文摘要

研究表明:高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）1Dx5+1Dy10是由染色体1D上两个紧密连锁的基因所控制,它们与面包烘烤品质有很大的关系。而利用转基因技术将HMW-GS1Dx5+1Dy10转入小麦栽培品种中以改良小麦加工品质是近年来的研究热点之一。但是,由于小麦基因表达的复杂性及人们对高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）1Dx5、1Dy10在面包加工过程中确切作用还了解不深,使得至今仍未能得到令人满意的结果。鉴于此,为了进一步了解sub5和sub10的结构及其在面包烘烤中的作用,本文对1Dx5、1Dy10基因分别在原核细胞中表达进行了研究。主要内容如下: 将麦谷蛋白亚基1Dx5和1Dy10分别克隆到表达载体pRSETA中,然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）plysS菌株中。在T7启动子控制下表达出融合蛋白,而其N端带有6xHis Tag标签有利于表达产物的分离纯化。IPTG诱导5小时后收获菌体,破碎、提取表达蛋白,并进行SDS-PAGE检测。为了提高目标蛋白的表达水平,进行了条件优化,诸如培养基、诱导时间和诱导剂量。麦谷蛋白亚基1Dx5和1Dy10最适条件分别是:在2YT培养基上1.0mmol.L-1IPTG诱导5h和在SOB培养基上1.0mmol.L-1IPTG诱导5h。SDS-PAGE分析表明:1Dx5和1Dy10重组蛋白分别占总可溶蛋白的16.3%和7.4%。

论文目录

• 摘要
• 1.文献综述
• 1.1 小麦高分子量谷蛋白亚基研究进展
• 1.1.1 小麦高分子量谷蛋白亚基概述
• 1.1.2 小麦高分子量谷蛋白亚基的遗传
• 1.1.3 小麦高分子量谷蛋白亚基与烘烤品质的关系
• 1.2 HMW—GS（1DX5+1DY10）亚基基因转化小麦的研究进展
• 1.3 载体简介及调控机制
• 1.3.1 pRSET-A载体
• 1.3.2 调控机制
• 1.4 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 1.4.1 启动子（promoter）的选择
• 1.4.2 分子伴侣的作用
• 1.4.3 二硫键的形成
• 1.4.4 提高活性蛋白表达策略
• 1.5 包涵体的产生及复性研究
• 2.引言
• 3.实验材料与方法
• 3.1 菌株与质粒
• 3.2 酶和化学试剂
• 3.3 基因
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 基因的亚克隆技术
• 3.4.2 培养基配制
• 3.4.3 质粒的提取及纯化
• 3.4.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3.4.5 菌体的培养
• 3.4.6 蛋白质提取及煮样
• 3.4.7 表达组分分析
• 3.4.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.4.9 发酵条件的优化
• 4.结果与分析
• 4.1 亚克隆质粒pET-17B载体+SUB5、SUB10目的基因的构建
• 4.2 表达载体的构建
• 4.3 麦谷蛋白SUB5，SUB10基因在大肠杆菌中的克隆及融合表达
• 4.4 发酵条件的优化
• 5.结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 培养条件对外源基因表达的影响
• 5.2.2 目的蛋白可溶组分的纯化和包涵体的纯化
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录
• 测序结果：SUB10
• 测序结果：SUB5