化学发光均相多组分DNA分析新技术

论文摘要

生物样本中生物活性物质的分析,尤其是蛋白质、基因序列分析,是一个涉及到多个学科的系统科学,依赖医学、化学、生物学、生物医学工程等学科的进步。多组分同时定量检测是目前蛋白质、基因序列等大分子化合物分析检测的热点,尤其是在临床诊断、环境监测等领域。相对于单一组分分析,多组分同时分析测定具有样品需求量少,分析时间短,重复步骤少,费用相对低等优点,受到越来越多人的关注。随着大量待筛选化合物不断涌现,生物分析技术面临着巨大的挑战。虽然传统的基于高密度多孔板的筛选技术目前还是生物分析的主要技术,但是随着人们对微球的效用、简单性以及多功能性的认识不断深入,微载体以及标记分辨技术已经开始展现出巨大的市场潜力。目前基于编码微球的筛选方法可以有效降低仪器成本和检测费用,但也面临如何提高编码数量、简化解码过程、提高检测速度和准确性、降低成本等方面问题,这些问题的解决有待于新型编码材料的出现、新的编码/解码策略的发明以及计算机辅助药物筛选等。本文主要包括三部分内容:首先综述了目前多组分检测技术的进展:然后构建了基于载体分辨的三种DNA同时分析新技术以及基于标记物分辨的三种DNA同时分析新技术。在载体分辨三种DNA同时分析新技术构建中,本文采用温度敏感高分子材料、磁珠、聚苯乙烯微球作为三种DNA同时分析载体,辣根过氧化物酶化学发光作为检测手段来实现人乳腺癌基因BRCAl三种DNA序列片段(60个碱基)的同时检测。由于三种载体具有不同的物理化学特性,如温度敏感高分子可以在最低临界溶液温度(LCST)31℃以上沉淀分离、磁珠磁场分离,聚苯乙烯微球简单离心分离的特性,三种DNA能够在同一试管中均相反应,定量检测前将三者简便分开,实现三组分同时检测。整个杂交过程非特异性吸附小,无明显的相互交叉干扰,检测灵敏度高,且文中构建的“一锅煮”反应步骤大大简化了操作过程。随后,在以上载体分辨单标记三组分成功检测的基础上,我们引入了标记物分辨三组分测定技术。本文以两种标记酶(碱性磷酸酯酶和辣根过氧化物酶)与一种纳米金属颗粒(金纳米微粒)作为三种不同报告DNA序列的标记物;磁珠为单一分离载体,同时固定三种捕获探针DNA序列;依次与目标靶DNA序列,标记报告DNA序列,标记酶或纳米金属颗粒反应;杂交反应结束后,采用不同检测底物予以检测载体复合物上不同标记物,获得相应目标靶DNA序列的浓度。杂交过程简便易行,无相互交叉反应,所构建的标记物分辨三种DNA同时分析新技术具有较高的灵敏度。此外,鉴于酶和纳米颗粒测定DNA线性范围的不同,本法能够适合于同时检测样本中含量相差很大的三种不同目标靶DNA序列。综上所述,本文成功构建了两种不同检测原理的三组分DNA分析方式,两种检测技术的集成有望实现更多组分的同时检测,本文所构建的具有创新意义的多组分化学发光技术,以其简便易行、快速可靠、灵敏度高等特点,能够为蛋白及DNA分析提供了有价值的选择途经。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一节 引言
• 第二节 综述
• 2.1 目前多组分检测技术的进展
• 2.2 载体分辨技术
• 2.2.1 微载体分辨技术
• 2.2.2 载体位置分辨技术
• 2.3 标记物分辨技术
• 2.3.1 金属离子和纳米粒子标记
• 2.3.2 荧光物质标记
• 2.3.3 多种酶标记
• 2.4 其他方法
• 2.5 本课题的主要研究内容及创新点
• 参考文献
• 第三节 载体分辨单标记均相多组分DNA分析
• 1 引言
• 2 仪器与试剂
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 3 实验部分
• 3.1 制备羧基温度敏感高分子（PNIP）
• 3.2 捕获探针DNA序列在载体表面的固定
• 3.3 杂交反应和检测步骤
• 4 结果与讨论
• 4.1 实验条件优化
• 5 小结
• 参考文献
• 第四节 标记物分辨单载体多组分DNA分析
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 磁珠表面固定捕获探针DNA序列
• 2.4 杂交反应和检测步骤
• 3 结果与讨论
• 3.1 优化测定参数
• 3.2 多组分DNA测定
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢