RGD肽修饰的壳寡糖硬脂酸聚合物胶团的肿瘤靶向性研究

论文摘要

两亲性聚合物在水性介质中,可自发形成具有独特核-壳结构的聚合物胶团,是一种具有广阔前景的肿瘤靶向给药系统。通过对胶团表面的修饰,如PEG修饰可达到给药系统的体内长循环目的,实现肿瘤的被动靶向,胶团表面的配体（如RGD、叶酸、半乳糖）和抗体等修饰,可实现药物的肿瘤组织主动靶向。本课题以壳聚糖酶降解后的低分子量壳聚糖-壳寡糖（Chitosan oligosaccharide, CSO）为原料,以碳二亚胺为交联偶合剂,将硬脂酸（stearic acid, SA）的羧基共价结合到壳寡糖的游离氨基上,得到壳寡糖-硬脂酸（CSO-SA）两亲性聚合物。为减少巨噬细胞对聚合物胶团的摄取,延长胶团在血液中的循环时间,在壳寡糖-硬脂酸（CSO-SA）表面嫁接PEG亲水链,得到聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸（PEG-CSO-SA）聚合物。为实现聚合物胶团对肿瘤细胞的主动靶向性,将RGD多肽引入聚合物中,得到RGD多肽-聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸（RGD-PEG-CSO-SA）聚合物。采用三硝基苯磺酸法测定聚合物的氨基取代度；采用芘荧光法测定聚合物在水中的临界胶团浓度（CMC）。聚合物分散于水相,制备得到聚合物胶团,采用微粒粒度及表面电位分析仪测定粒径与表面电位；以BEL-7402（细胞表面过表达αvβ3整合素受体）和Hela（细胞表面不过表达αvβ3整合素受体）细胞系为模型细胞,采用MTT法测定聚合物胶团的细胞毒性；以异硫氰基（FITC）荧光标记聚合物,考察聚合物胶团的细胞摄取情况。以阿霉素（Doxorubicin, DOX）为模型药物,采用透析法制备聚合物载药胶团,以微粒粒度及表面电位分析仪测定载药胶团的粒径与表面电位；超滤离心法测定载药胶团的包封率和载药量；透析袋法考察聚合物载药胶团的体外释放行为；MTT法测定载药胶团对BEL-7402和Hela细胞的毒性；在荧光显微镜下观察聚合物载药胶团在BEL-7402和Hela细胞上的摄取情况,并定量分析阿霉素的细胞摄取率。采用竞争性实验,将BEL-7402细胞与游离的RGD多肽预孵育30min,待细胞表面的αvβ3整合素受体“饱和”后考察载药胶团的细胞摄取情况,验证RGD多肽在胶团肿瘤主动靶向中的介导作用。采用偶合反应将硬脂酸嫁接到壳寡糖上,得到的壳寡糖-硬脂酸聚合物（CSO-SA）的氨基取代度为19.6±0.60%（n=3）,水中的临界胶团浓度（CMC）为25.0±0.3μg/ml（n=3）。壳寡糖-硬脂酸聚合物用聚乙二醇（PEG）和RGD多肽修饰后,在水中的临界胶团浓度（CMC）增大。聚合物分散于水中得到浓度为1.0mg/mL的胶团,微粒粒度与表面电位分析仪测得,聚乙二醇和RGD多肽修饰后胶团粒径增加,表面电位下降。细胞毒性实验显示,聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸（PEG-CSO-SA）和RGD多肽-聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸（RGD-PEG-CSO-SA）聚合物胶团对BEL-7402和Hela细胞IC50值在290～500μg/ml之间,是安全的载体材料。FITC标记的聚合物胶团在细胞系上的摄取实验显示,RGD多肽修饰可显著增加胶团在BEL-7402细胞系上的摄取,对Hela细胞系的摄取无明显影响。透析法制备得到的阿霉素聚合物载药胶团,包封率在90%以上,在pH7.4的PBS释放介质中表现出良好的缓释效果。细胞毒性实验显示,RGD多肽修饰能够显著提高载药胶团在BEL-7402中的细胞毒性达7.2倍（48h毒性）,而在Hela细胞系上则无明显差异。细胞定量和定性摄取结果显示,RGD多肽的修饰可显著增加胶团对过表达αvβ3整合素受体的肿瘤细胞（BEL-7402）的识别能力,增加其细胞摄取百分率,而对于不过表达αvβ3整合素受体的肿瘤细胞,则没有明显差异。在竞争性试验中,BEL-7402细胞预先与游离的RGD多肽孵育30min后,可明显抑制RGD修饰的载药胶团的细胞摄取,表明RGD多肽-聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸（RGD-PEG-CSO-SA）聚合物胶团的肿瘤主动靶向性是RGD多肽介导的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 聚合物胶束的特点
• 1.2 聚合物胶束的肿瘤靶向性
• 1.2.1 肿瘤被动靶向性
• 1.2.2 肿瘤主动靶向性
• 1.3 聚合物胶束的制备方法与载药机制
• 1.3.1 化学键合法
• 1.3.2 物理包埋法
• 1.4 RGD多肽及其肿瘤靶向基础
• 1.4.1 RGD多肽简介
• 1.4.2 RGD肽的肿瘤靶向基础
• 1.5 外源RGD肽及其衍生物
• 1.6 RGD肽在肿瘤靶向聚合物胶束给药系统中的应用
• 1.7 本课题的立题背景及意义
• 1.8 本课题研究内容
• 第二章 RGD修饰壳寡糖硬脂酸聚合物的合成及其理化性质评价
• 2.1 材料与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 壳寡糖-硬脂酸聚合物的合成
• 2.2.2 聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸聚合物的合成
• 2.2.3 RGD多肽-聚乙二醇-壳寡糖-硬脂酸聚合物的合成
• 2.2.4 聚合物的氨基取代度测定
• 2.2.5 聚合物的临界胶团浓度的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 两亲性聚合物的合成
• 2.3.2 壳寡糖-硬脂酸聚合物的氨基取代度
• 2.3.3 聚合物的临界胶团浓度
• 2.4 本章小结
• 第三章 RGD修饰壳寡糖硬脂酸聚合物胶团的制备与理化性质评价
• 3.1 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 聚合物胶团的粒径与表面电位测定
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 聚合物胶团的细胞毒性测定
• 3.2.4 聚合物胶团的荧光标记
• 3.2.5 聚合物胶团细胞摄取及荧光显微镜定性观察
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 聚合物胶团的粒径与表面电位
• 3.3.2 聚合物胶团的细胞毒性
• 3.3.3 聚合物胶团细胞摄取及荧光显微镜定性观察
• 3.4 本章小结
• 第四章 阿霉素聚合物载药胶团的制备与抗肿瘤药效学研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 碱基阿霉素的制备及其含量测定
• 4.2.2 阿霉素载药胶团的制备及粒径与表面电位测定
• 4.2.3 载药胶团包封率与载药量的测定
• 4.2.4 载药胶团的体外释放
• 4.2.5 载药胶团细胞毒性测定
• 4.2.6 载药胶团细胞摄取定性观察
• 4.2.7 载药胶团细胞摄取定量研究
• 4.2.8 竞争性摄取实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 载药胶团的粒径与表面电位
• 4.3.2 载药胶团的包封率与载药量
• 4.3.3 载药胶团的体外释放
• 4.3.4 载药胶团的细胞毒性
• 4.3.5 载药胶团的细胞摄取定性观察
• 4.3.6 载药胶团细胞摄取定量研究
• 4.4 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况