3-羟基丙酸合成途径关键酶及再激活因子基因在大肠杆菌中的表达研究

论文摘要

3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid, 3-HP）是一种重要的平台化合物,以它为出发原料能合成多种化工产品及日用品。微生物转化法合成3-羟基丙酸因其成本低,条件温和,绿色环保等优势有着广泛的应用前景。随着基因工程技术的发展,利用基因工程技术对菌种进行改造,是实现生物法利用可再生资源转化生产3-HP工业化的重要手段之一。而目前关于生物法生产3-羟基丙酸的研究尚处于起步阶段,相关报道并不多见。本课题利用分子生物学技术对甘油转化生产3-羟基丙酸代谢途径中的关键酶基因在大肠杆菌中的表达进行研究。利用克隆技术获得甘油转化为3-羟基丙酸代谢途径中的关键酶基因——来源于酿酒酵母的乙醛脱氢酶编码基因aldH,以及来源于克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因dhaB,将3-羟基丙酸合成关键酶基因aldH、dhaB进行串联,构建含双tac启动子的串表达载体pEtac-dhaB-tac-aldH,将其转入E.coli JM109中获得产3-羟基丙酸重组菌E.coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH。经SDS-PAGE鉴定,关键酶基因得到正确表达。以已构建的产3-羟基丙酸关键酶基因共表达的重组菌E.coli JM109/pEtac-dhaB, pUC-tac-aldH作为对照,与构建的产3-羟基丙酸关键酶基因串表达的重组大肠杆菌进行关键酶的活性、重组质粒的稳定性以及产物3-羟基丙酸的合成量的对比。结果表明,产3-羟基丙酸关键酶基因串表达的重组菌E.coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH与共表达重组菌E.coli JM109/pEtac-dhaB, pUC-tac-aldH相比,表达的甘油脱水酶DHAB的活性提高了41.5%,乙醛脱氢酶ALDH的活性提高了3.5%;串表达重组质粒的稳定性提高了29.4%;最终3-羟基丙酸的合成量提高了52.6%。研究结果表明,串表达关键酶基因有利于重组大肠杆菌合成3-羟基丙酸。甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。本研究克隆了来源于克雷伯氏菌基因组中,编码DHAB基因的甘油脱水酶再激活酶基因gdrA、gdrB,并重新构建串联有gdrA、gdrB、dhaB、aldH基因的表达质粒pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH,获得重组菌E.coli JM109/ pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH。进一步考察甘油脱水酶再激活因子对3-羟基丙酸生物合成的影响。在好氧条件下发酵, E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH的3-羟基丙酸合成量为2.51 g/L,与E. coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH相比,3-羟基丙酸合成量提高了3.3倍。经初步发酵优化后E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH的3-HP合成量为4.01 g/L ,比优化前提高了60%。研究结果表明,甘油脱水酶再激活因子能有效激活甘油脱水酶的活性从而提高了目标产物3-羟基丙酸的生物合成量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 3-羟基丙酸的理化性质
• 1.1.2 3-羟基丙酸的应用领域及市场情况
• 1.2 化学法合成3-羟基丙酸的研究进展
• 1.3 生物法合成3-羟基丙酸的研究进展
• 1.3.1 野生菌株合成3-羟基丙酸的研究进展
• 1.3.2 基因工程菌株合成3-羟基丙酸的研究进展
• 1.4 本论文的研究意义和主要研究内容
• 1.4.1 本课题的来源及研究意义
• 1.4.2 本论文的主要内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验方法
• 2.2.2 分析方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 产3-羟基丙酸重组大肠杆菌的构建
• 3.1.1 产3-羟基丙酸关键酶基因共表达重组大肠杆菌的构建
• 3.1.2 产3-羟基丙酸关键酶基因串表达重组大肠杆菌的构建
• 3.2 产3-羟基丙酸关键酶基因共表达和串表达重组大肠杆菌的对比
• 3.2.1 产3-羟基丙酸重组大肠杆菌关键酶基因的表达
• 3.2.2 产3-羟基丙酸重组大肠杆菌关键酶活性的对比
• 3.2.3 产3-羟基丙酸重组大肠杆菌重组质粒稳定性的对比
• 3.2.4 产3-羟基丙酸重组大肠杆菌3-羟基丙酸合成量的对比
• 3.2.5 重组大肠杆菌发酵产物3-羟基丙酸的检测
• 3.3 甘油脱水酶再激活因子对重组大肠杆菌合成3-羟基丙酸的影响
• 3.3.1 甘油脱水酶基因及其再激活因子dhaB-gdrA 以及gdrB 的克隆
• 3.3.2 重组质粒pEtac-dhaB-gdrA 的构建
• 3.3.3 重组质粒pUC-gdrB-tac-aldH 的构建
• 3.3.4 重组质粒pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH 的构建
• 3.3.5 重组大肠杆菌 E.coli JM109
• 3.3.6 重组大肠杆菌E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH 的酶活分析
• 3.3.7 重组大肠杆菌 E.coli JM109
• 3.3.8 重组大肠杆菌E.coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH 初步发酵实验
• 3.4 重组大肠杆菌产3-羟基丙酸的初步发酵优化
• 3.4.1 初始甘油浓度对重组大肠杆菌发酵的影响
• 3.4.2 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响
• 2+浓度对重组菌发酵的影响'>3.4.3 Mg²⁺浓度对重组菌发酵的影响
• 3.4.4 K+浓度对重组菌发酵的影响
• 12 浓度对重组菌发酵的影响'>3.4.5 维生素B₁₂浓度对重组菌发酵的影响
• 3.4.6 IPTG 加入量对重组菌发酵的影响
• 3.4.7 接种量对重组菌发酵的影响
• 结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文