广东省深圳市人民医院放疗科518020
【摘要】目的：探讨血浆EBV-DNA定量分析在鼻咽癌患者放疗后随诊中筛查鼻咽癌转移或复发的价值。方法：应用荧光定量PCR技术，检测210例根治放疗后鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平，并与临床、影像、鼻咽纤维镜及病理检查结果进行比较分析。结果：210例患者中48例血浆EBV-DNA检测阳性，162例阴性。在48例检出阳性者中，25例证实为鼻崖癌临床复发，11例证实为远处转移，4例证实为既有复发，又有远处转移，故其预测肿瘤进展阳性预测值为83.33%（40/48）；在156例临床缓解患者中，共有148例血浆EBV-DNA检测阴性，故其诊断特异性为94.87%（148/156）；放疗后缓解组患者血浆EBV-DNA阳性率为5.12%（8/156），与放疗后复发或转移组患者血浆EBV-DNA阳性率[83.33%（40/48）]比较差异有显著性（P＜0.01）；放疗后缓解组患者血浆EBV-DNA中位拷贝数为0copy/mL，与放疗后复发或转移组患者血浆EBV-DNA中位拷贝数（＞1000copy/mL）比较差异有显著性（P＜0.01）。结论：血浆EBV-DNA的实时定量PCR分析对放疗后鼻咽癌患者的筛查有实用价值，是监测放疗后鼻咽癌患者转移、复发的重要指标。
【关键词】鼻咽肿瘤；EBV-DNA；诊断；复发
【中图分类号】R739.6【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-07-032-02
鼻咽癌在我国南方高发，系恶性程度较高的肿瘤，放谢治疗是首选的治疗方式。治疗失败的主要原因是局部区域复发或远处转移，因此，放射治疗后的鼻咽癌患者仍要定期复查，以便及早发现小的转移灶或复发病灶，再及时给予进一步的治疗，以提高最终治疗效果。
鼻咽屿EB病毒密切相关，检测EB病毒的相关抗体是诊断及监测患者病情变化的常用方法。近年来，由于定量PCR技术的发展，直接定量检测血浆中游离病毒DNA逐渐受到重视。有报道，测定血清中的EBV-DNA拷贝数可作为诊断及监测患者病情变化的手机之一，荧光定量PCR技术定量检测鼻咽癌患者外周血浆EB病毒DNA的拷贝数，也有希望作为鼻咽癌放疗后随诊一种新的有效手段，及时筛查较早复发、转移患者。
1资料与方法
1．1一般资料选择2006年3月至2008年12月本院210例根治性放疗后的鼻咽癌患者，所有患者初诊时均经病理学诊断为非角化型未分化癌或分化癌（WHO分类）接受根治性放射治疗。其中男120例，女90例，年龄17~82岁，中位年龄50岁。距放疗结束时间3~24个月，中位时间15个月。
1．2临床检查方法临床检查内容包括鼻咽MRI（包括颅底和全颈）、电子鼻咽镜检查、胸部X线片、腹部B超、全身骨核素扫描检查。胸片或腹部B超有可疑转移则行胸部或腹部CT扫描。鼻咽部临床诊断需行鼻咽部活检并经病理检查证实。
1．3实验方法荧光定量PCR反应EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒购买自中山大学达安基因股份有限公司，包括DNA提取液、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性标准品、阴性质控品以及PCR反应管等。所扩增的目的基因来自EBV-DNA的EBNA-1片段，上下游引物分别为：5’-2GTAGAAGGCCATTTTTCCAC-3’和5’-TTTCTACGTGACTCCTAGCC-3’。每批PCR反应用克隆合成的EB病毒W片段作为阳性对照，并稀释成不同的浓度梯度（106、105、104、103、103、102、101copy/mL）进行PCR反应；用蒸馏水作为阴性对照。PCR反应在PE7700自动荧光PCR仪上进行。
1．4随访210例患者随访截止时间为2008年12月31日，中位随访时间15（3~24）个月，经临床检查证实放疗后缓解156例，局部复发31例，远处转移19例，4例证实既有复发又有远处转移，复发和转移病例均接受进一步放疗、化疗。
1．5统计学分析使用SPSS10.0统计软件，EB病毒DNA拷贝数的比较用Mann-WhitneyU非参数秩和检验（Mann-WhitneyU检验），组间阳性率比较采用X2检验。
2结果
2．1随诊情况抽血进行血浆EBV-DNA检测时，210例患者随访截止时间为2008年12月31日，中位随访时间15（3~24）个月，经临床检查证实放疗后缓解156例，局部复发31例，远处转移19例，4例证实既有复发又有远处转移。其中单纯肝转移4例，肺转移3例，骨转移11例，纵隔淋巴结转移2例，复合转移3例。
2．2放疗后复查鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平测定210例根治性放疗后的鼻咽癌患者中，48例检测阳性，162例检测为阴性。在48例检测阳性者中，25例同时经临床或影像学和病理检查证实为临床复发，11例证实为远处转移，4例证实既有复发又有远处转移，故其预测肿瘤进展阳性预测值为83.30%（40/48）；在162例血浆EBV-DNA检测阴性患者中，7例在检测当时诊断为复发，3例转移，经过3个月随访后，又出现2例复发和2例转移，故其阴性预测值为91.30%（148/162）；54例肿瘤复发或转移者中，14例EBV-DNA检测阴性，故假阴性率为25.90%（14/54）；在54例临床确诊复发转移患者中，共有40例血浆EBV-DNA阳性，故诊断敏感性为74.07%（40/54）；在156例临床缓解患者中，共有148例血浆EBV-DNA检测阴性，故其诊断特异性为94.87%（148/156），见表1。
2．3治疗后缓解组与复发或转移组患者血浆EBV-DNA阳性率及含量比较放疗后缓解组患者血浆EBV-DNA阳性率为5.12%（8/156），与放疗后复发或转移组患者血浆EBV-DNA阳性率[83.33%（40/48）]比较差异有显著性（P＜0.01）；放疗后缓解组患者血浆EBV-DNA中位拷贝数为0copy/mL，与放疗后复发或转移组患者血浆EBV-DNA中位拷贝数（＞1000copy/mL）比较差异有显著性（P＜0.01）。
3讨论
有报道鼻咽癌放疗后血浆EBV-DNA的含量与肿瘤的复发和转移相关，并且认为监测血浆EBV-DNA的含量变化可能成为一个早期检测肿瘤复发和转移的有价值的方法，传统的影像检查有时在诊断较小的转移灶、放疗后颈部肿瘤浸润与纤维化的鉴别，以及残存肿物性质和判断方面往往是无能为力的。因此，寻找一种有效的鼻咽癌方面的肿瘤标记物，并以此来指导我们临床工作是必要的和十分有意义的。李宇红等[1]研究初治、远处转移和局部复发的NPC患者血浆中游离EBV-DNA检出率分别为96.0%、95.0%和100%，显著高于治疗后持续缓解NPC患者、健康对照者和非NPC的肿瘤患者。治疗前血浆EBV-DNA中位拷贝数，晚期患者（Ⅲ、Ⅳ期）显著高于早期患者（Ⅰ、Ⅱ期），复发和转移者显著高于未复发转移者。放射治疗后EBV-DNA中位拷贝数，复发、转移者显著高于持续缓解患者。治疗前血浆EBV-DNA中位拷贝数越高，放射治疗效果越差。
本研究中也显示，在复发或有远处转移的患者中，检测出EBV-DNA的阳性率明显高于临床缓解组，并且拷贝数也有明显的差异。我们通过210例放疗后鼻咽癌患者随诊发现，83.3%EBV-DNA阳性患者在检测当时或经过中位时间3个月内出现肿瘤复发或转移，而EBV-DNA阴性患者出现肿瘤进展的可能性为8.0%，说明通过EBV-DNA检测可以有效区分不同患者治疗后的肿瘤进展风险。对于EBV-DNA阳性患者，应该进行更全面的临床和影像学检查。即使目前的检查手段未能发现肿瘤复发或转移，EBV-DNA检测阳性者在未来较短的时间内出现肿瘤进展的可能性也远远高于EBV-DNA阴性者，说明EBV-DNA检测阳性者需要进行更加密切的随访，如缩短随访的间隔时间等。而处于临床缓解期同时EBV-DNA检测阴性患者在3个月内出现肿瘤进展的可能性极低，说明每3~6个月1次的随访不至于漏诊可能出现的肿瘤复发或远处转移。Lin等[2]亦得出相似结果，并认为EBV-DNA为最重要的预后因子，且放射治疗后1周检测血浆EBV-DNA为预测复发的最佳时间。本研究认为10~15个月检测血浆EBV-DNA为预测复发的最佳时间，因复发大多发生在该时段，而放射治疗后1周大多为残留可能。
EB病毒与NPC关系密切，有研究证实在肿瘤患者的血浆和血清中可以检测到肿瘤细胞来源的DNA，为我们在肿瘤的诊断、治疗和判断预后方面提供了一种新的非侵入性手段[3]。Jiang等[4]检测了74例NPC患者血浆中EBV-DNA，治疗前阳性率为95.9%（71/74），在放疗50Gy/5周后检测发现其中23例肿块消失的患者EBV-DNA的阳性率为13.0%（3/23），而对于其余仍有肿块的患者阳性率达62.7%%（32/51）；在放疗结束（70Gy/7周）后，有7例仍然有肿瘤残余，而其中有5例（71.4%）可检测出病毒DNA，其余肿块完全消失的患者血浆中EBV-DNA都不可检测出。这些都说明治疗期间动态监测NPC患者血浆EBV-DNA可一定程度上了解肿块消退的情况，及时对疗效作出有效的评估。Leung等[5]测定NPC患者EBV-DNA敏感度为95%，而VCA-IgA敏感度为81%，并证实血浆EBV-DNA敏感性和特异性均高于VCA-IgA，有可能取代VCA-IgA成为NPC筛查及早期诊断指标。Makitie等[6]首次报道EBV-DNA浓度水平与正电子发射计算机体层显影在预测NPC复发方面的一致性。鼻咽癌患者复发或远处转移的诊断主要依赖影像学检查，但影像学检查有时对诊断复发或转移是不敏感的。患者体内存在着肿瘤的微小残留或微小转移病灶，现有的检查方法尚未能检出，但血浆EBV-DNA即已出现阳性。龚晓昌等[7]研究表明，放疗后复发和（或）转移患者的EBVDNA阳性率和拷贝数均显著高于肿瘤持续缓解者。侯雪等[8]研究了血浆EBV-DNA浓度与肿瘤负荷的关系，以及不同时期（治疗前或治疗后）EBV-DNA的临床意义，进一步探讨NPC治疗前、后血浆EBV-DNA浓度的意义，及其与肿瘤负荷、临床疗效，尤其是远处转移的关系，探索其作为分子分期指标指导临床治疗选择的可行性，认为治疗后EBV-DNA浓度能否降为0是预测患者是否出现远处转移的重要分子生物学标志，张力等[9]认为鼻咽癌患者血EBV-DNA水平与肿瘤复发关系密切，值得进一步研究。因此，荧光定量PCR技术定量检测鼻咽癌患者外周血浆EB病毒DNA的拷贝数，有希望作为鼻咽癌放疗后随诊一种新的有效手段，及时筛查较早复发、转移患者。
参考文献：
[1]李宇红，邵建永，冯惠霞，等.鼻咽癌患者血浆游离EBV-DNA的定量检测及其临床意义[J].中国肿瘤临床，2004，31（8）：421-424.
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[7]龚晓昌，李金高，袁霞，等.血浆EBV-DNA水平测定在监测鼻咽癌放疗后复发、转移中的临床意义[J].实用癌症杂志，2007，22（2）；150-153.
[8]侯雪，张力，赵充，等.血浆EB病毒DNA浓度预测鼻咽癌远处转移的研究[J].癌症，2009，25（7）：785-792.
[9]张力，李苏，赵充，等.鼻咽癌患者血浆EB病毒NDA水平与肿瘤复发的关系[J].临床肿瘤学杂志，2010，9（2）：122-125.