论文摘要
目的：利用高效液相色谱-质谱联用系统（HPLC-MS）分析肝细胞肝癌患者肝组织代谢轮廓,寻找潜在肿瘤代谢标志物组,辅助肿瘤的早期诊断。并通过对肝癌患者血浆及肿瘤组织中游离氨基酸的分析及其与肿瘤体积相关性的探讨,为肝癌的辅助诊断、营养支持以及氨基酸失衡液的临床应用奠定基础。方法：收取2009年11月-2010年7月在天津市第三中心医院肝胆外科住院的13例原发性肝癌患者（经病理证实）的肝癌组织、癌旁过渡组织、正常肝组织标本并对组织样本进行适当前处理。利用HPLC-MS对样本进行检测；利用MZmine2.0软件对得到的数据进行前处理,再将处理所得数据导入到SIMCA-P+12.0.1.0（瑞典Umetrics公司）进行分析。通过SIMCA-P+12.0.1.0的模式识别方法构建正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型,根据VIP值及VIP置信区间进行代谢标志物的初步筛选,然后利用SPSS 15.0 （SPSS, USA）对筛选出的代谢标志物进行独立样本非参数检验排除P值大于0.05的变量进而筛选出潜在代谢标志物。并利用L-8900高效液相氨基酸分析仪对血浆及组织标本进行氨基酸分析,利用数据分析软件SPSS15.0并结合肿瘤体积分析血浆、癌组织游离氨基酸变化及与肿瘤体积的相关性。结果：1.基于肝癌患者组织代谢物建立的OPLS-DA模型,该模型能够很好地区分正常组、过渡组织组和癌组织组。2.寻找到46个特异性的代谢物离子,鉴定出了其中的36个,其中经鉴定的37个潜在标志物在过渡组织和癌组织中均呈下调趋势的有Lewis X trisaccharide、、PC（22:6）、Palmitaldehyde、Palmitic acid;只在癌组织中下调的有Geranyl-PP、Homoanserine、MG（20:5）;只在癌组织中上调的有3,4,5-Trimethoxycinnamic acid、PG;在过渡组织和癌组织中均上调的Aminoacetone、2-Aminomuconic acid、Adenine、NNK、LPA（0:0/20:4）、13E-Tetranor-16-carboxy-LTE4、7-Methylguanosine、CPA（16:0/0:0）、7,8-Dihydroneopterin、LPA（16:0/0:0）、Taurocholic acid 3-sulfate、Vaccenic acid、TG、Alpha-CEHC、Hemin、PE（14:1/14:0）、LPE（22:5）、Protoporphyrinogen IX、LPC（17:0）、LPC（18:0）、L-Aspartic acid、2-Aminobenzoic acid、Oxalosuccinic acid、Palmitic acid、Phenylalanylphenylalanine。3.肝癌组血浆游离氨基酸与正常组比较,门冬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸明显降低,（p<0.05）,胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸明显升高（p<0.05）,支链氨基酸降低、芳香族氨基酸升高（p<0.05）,支芳比呈降低趋势（p<0.05）。4.与正常肝组织相比癌旁过渡组织中大多数氨基酸发生变化且具有统计学意义（P<0.05）,与癌旁组织相比,肝癌组织中升高的氨基酸有牛磺酸、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸,降低的有丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、鸟氨酸。与正常肝组织相比,在癌旁组织和肝癌组织中呈持续上升趋势的氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸；呈持续下降趋势的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、组氨酸,其他如牛磺酸、苏氨酸、谷氨酸则在过渡组织中降低而在肝癌组织中升高。5.肝癌组织游离缬氨酸（r=-0.812）、蛋氨酸（r=-0.920）、亮氨酸（r=-0.71）酪氨酸（r=-0.812）、精氨酸（r=-0.87），对应血浆游离氨基酸成负相关：6.肝癌组织游离苏氨酸（r=0.90）、谷氨酸（r=0.87）、缬氨酸（r=0.93）、蛋氨酸（r=0.86）、异亮氨酸（r=0.95）、亮氨酸（r=0.92）、酪氨酸（r=0.89）、苯丙氨酸（r=0.84）等均与肿瘤体积成正相关。结论：本研究发现PC/PE、LPA/CPA、氨基丙酮、NNK、7-甲基鸟苷等7种物质对肝癌的发生发展变化有意义,有望成为HCC代谢标志物。本实验表明由组织代谢轮廓构建的OPLS-DA模型可以很好的区分肝癌的发展阶段,并成功发现和初步鉴定出区分各个阶段的相应代谢标志物；研究结果为寻找肝癌分子标志物、研究肝癌代谢相关通路研究及肝癌的早期诊断提供了新的思路与方法。本研究发现由于代谢紊乱,血浆和1组织中大多数氨基酸发生改变且改变具有统计学意义,缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸在血浆和组织中的含量存在较大差异且与肿瘤大小成正相关,其它如精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等均影响肝癌的进程。组织氨基酸分析为肝癌患者的辅助诊断、营养支持以及治疗奠定了临床基础。