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PRRSV N基因原核双基因表达载体与毕赤酵母表达载体的构建及其表达研究

2020-11-30阅读(899)

PRRSV N基因原核双基因表达载体与毕赤酵母表达载体的构建及其表达研究

论文摘要

本研究以RT-PCR分别扩增了PRRSV美洲型N基因（以NA表示）和欧洲型N基因（以NE表示）,并开展了以下两方面的研究:（1）将NA和NE基因片段同时插入pET-32a（+）中构建了双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE,并进行了表达研究;（2）将NA和NE基因片段分别插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建了pPIC9K-NA和pPIC9K-NE,并进行了表达研究。本研究为深入研究N蛋白的结构与功能、制备诊断试剂及开展分型诊断等奠定了基础,对PRRS的防控具有重要的意义。1.双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE的构建及其表达研究针对美洲型和欧洲型PRRSV N基因设计两对特异性引物,以RT-PCR扩增获得NA和NE基因,分别插入pMD19-T simple载体中,构建了pMD19-T-NA和pMD19-T-NE,并对两重组质粒进行了测序鉴定。将pMD19-T-NA和pET-32a（+）经NcoⅠ& EcoRⅠ双酶切后连接构建了pET-32a（+）-NA重组质粒;再将pET-32a（+）-NA和pMD19-T-NE经EcoRⅠ& NotⅠ双酶切后连接构建了双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE。pET-32a（+）-NA-NE经PCR和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段,结果表明成功构建了双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE。将pET-32a（+）-NA-NE转化大肠杆菌BL21进行了表达,IPTG最佳诱导浓度为1.0mM/L,最佳诱导时间为3h;经SDS-PAGE分析表达的融合N蛋白（NA-NE蛋白）大小约为49kD;经Western blotting表明,该融合N蛋白具有良好的反应原性。2.毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及其表达研究针对NA基因重新设计一对引物（只更换酶切位点）扩增获得了NA基因,插入pMD19-T simple载体中构建了pMD19-T-NAl。将pMD19-T-NAl和pMD19-T-NE经EcoRⅠ& NotⅠ双酶切后回收NA和NE基因片段,分别插入经EcoRⅠ& NotⅠ双酶切处理的pPIC9K中构建了毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE,并分别对两种重组质粒进行了PCR和双酶切鉴定。pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经PCR鉴定和不同双酶切鉴定均得到预期大小的片段,结果表明成功构建pPIC9K-NA和pPIC9K-NE。将pPIC9K-NA和pPIC9K-NE经SacⅠ线性化后分别电转化毕赤酵母宿主菌GS115,再经G-418/YPD筛选获得高拷贝数重组子;重组子经表型鉴定为Mut+,且PCR鉴定为阳性。阳性重组子经甲醇诱导表达,在96h表达产物量最大,SDS-PAGE显示表达产物大小均约为15kD,Dot blotting表明表达的两型N蛋白均能与相应型阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 1.猪繁殖与呼吸综合征研究进展
  • 2.原核表达系统研究进展
  • 3.巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
  • 4.本研究目的与意义
  • 1.材料
  • 1.1 毒株及细胞
  • 1.2 菌株及载体
  • 1.3 主要试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 2.方法
  • A）和欧洲型N基因（NE）的克隆'>2.1 PRRSV美洲型N基因（NA）和欧洲型N基因（NE）的克隆
  • 2.1.1 引物设计
  • A和NE基因的扩增及回收'>2.1.2 NA和NE基因的扩增及回收
  • A和NE基因的克隆及鉴定'>2.1.3 NA和NE基因的克隆及鉴定
  • A和NE基因及推导编码蛋白相关生物信息学分析'>2.1.4 NA和NE基因及推导编码蛋白相关生物信息学分析
  • A-NE的构建及其表达研究'>2.2 双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE的构建及其表达研究
  • A-NE的构建与鉴定'>2.2.1 pET-32a（+）-NA-NE的构建与鉴定
  • 2.2.2 融合N蛋白的诱导表达
  • 2.2.3 融合N蛋白Western blotting分析
  • A和pPIC9K-NE的构建及其表达研究'>2.3 毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及其表达研究
  • 2.3.1 引物设计
  • A基因的扩增'>2.3.2 NA基因的扩增
  • A基因克隆及鉴定'>2.3.3 NA基因克隆及鉴定
  • A和pPIC9K-NE的构建及鉴定'>2.3.4 pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及鉴定
  • 2.3.5 重组表达载体质粒的转化
  • 2.3.6 毕赤酵母重组子的筛选及鉴定
  • 2.3.7 阳性重组子诱导表达及SDS-PAGE分析
  • 2.3.8 表达产物Dot blotting鉴定
  • 3.结果
  • A和NE基因的克隆'>3.1 NA和NE基因的克隆
  • A和NE基因的扩增'>3.1.1 NA和NE基因的扩增
  • A和NE基因克隆载体的鉴定'>3.1.2 NA和NE基因克隆载体的鉴定
  • A和NE基因克隆载体序列分析'>3.1.3 NA和NE基因克隆载体序列分析
  • A和NE基因序列分析及相关生物信息学分析'>3.1.4 NA和NE基因序列分析及相关生物信息学分析
  • A-NE的构建及其表达研究'>3.2 双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE的构建及其表达研究
  • A-NE的鉴定'>3.2.1 pET-32a（+）-NA-NE的鉴定
  • 3.2.2 融合N蛋白诱导表达及SDS-PAGE分析
  • 3.2.3 融合N蛋白Western blotting分析
  • A和pPIC9K-NE的构建及其表达研究'>3.3 毕赤酵母表达载体pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的构建及其表达研究
  • A基因的扩增'>3.3.1 NA基因的扩增
  • A基因克隆载体的鉴定'>3.3.2 NA基因克隆载体的鉴定
  • A基因克隆载体序列分析'>3.3.3 NA基因克隆载体序列分析
  • A和pPIC9K-NE的鉴定'>3.3.4 pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的鉴定
  • 3.3.5 毕赤酵母重组子的筛选及鉴定
  • 3.3.6 表达产物SDS-PAGE分析
  • 3.3.7 表达产物Dot blotting分析
  • 4.讨论
  • 4.1 关于PRRSV N基因及N蛋白
  • A-NE的构建及其表达研究'>4.2 双基因融合表达载体pET-32a（+）-NA-NE的构建及其表达研究
  • 4.2.1 融合表达设计
  • 4.2.2 原核表达系统的选择
  • 4.3 两型N蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
  • 5.结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附图

    • 相关论文文献

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