Kisspeptin-10对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究

论文摘要

Kisspeptin是Kiss-1基因编码的一种肽类激素,它由下丘脑分泌并可控制促性腺激素释放激素（gonadtrophin-releasing hormone, GnRH）的分泌,从而调控的生殖启动。也有研究报道,kisspeptin同样存在于外周生殖器官中。在哺乳动物上,kisspeptin的生物学功能得到广泛研究。目前,尽管在鸭下丘脑已经鉴定出kisspeptin的阳性信号,但其在禽上的功能研究尚且不多。孕酮是禽类排卵前黄体生成素（leitinizing hormone, LH）峰的正反馈调节信号,同时也是禽类卵泡发育状态的信号和排卵启动及维持的重要调节因子。因此,本试验建立了鸡卵巢颗粒细胞体外培养方法,并进行了细胞学鉴定,同时研究kisspeptin对鸡体外培养的卵巢颗粒细胞孕酮分泌的直接作用。旨在探讨：1、是否与哺乳动物类似,鸡的卵巢也具有分泌kisspeptin的能力。2、kisspeptin对体外培养的卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响。3、kisspeptin调节卵巢颗粒细胞孕酮分泌的可能机制。1 Kisspeptin-10对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集卵泡,分离纯化颗粒细胞,并用有血清培养基培养培养1d,随后用无血清培养基培养。在无血清培养基稳定24 h后,用Kisspeptin-10 （Kp-10）、维拉帕米（Verapamil）和EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清及细胞,分别检测孕酮含量和胞内Ca2+浓度。细胞免疫荧光或免疫化学法鉴定颗粒细胞卵泡刺激素受体（FSHR）及kisspeptin的阳性表达,MTT法检测细胞活力,放射免疫学方法（RIA）检测孕酮含量,流式细胞技术法检测细胞内Ca2+浓度。结果显示：1、体外培养的细胞存在FSHR的阳性表达,结合形态学观察可鉴定其为鸡卵巢颗粒细胞。2、颗粒细胞上具有Kisspeptin-10样免疫活性物质的阳性表达,提示体外培养的鸡卵巢颗粒细胞具有自分泌kisspeptin的能力。3、Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞活力,100 nM时可显著促进孕酮的分泌（P<0.05）。4、钙离子阻断剂Verapamil（1-100μM）呈剂量依赖性降低孕酮的分泌,于100μM时达显著降低水平（P<0.05）；与Verapamil单独处理组相比,100 nM Kp-10与1μM Verapamil共同处理可显著增加孕酮的分泌（p<0.05）,而与10、100μM Verapamil共同处理则不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用。此外,胞内钙离子含量与上清液中孕酮分泌水平相一致。5、与100nM Kp-10处理组相比,与1或5 mM EGTA共同处理时孕酮分泌显著降低,当再加入1.5 mMCa2+时孕酮分泌量显著增加。以上结果提示：Kisspeptin-10促进体外培养的鸡卵巢颗粒细胞孕酮的分泌,其作用机制可能与胞内Ca2+信号通路有关。2 Kisspeptin-10调节颗粒细胞孕酮分泌的作用机制研究与试验一方法相同,获得卵巢颗粒细胞并分等级培养（F1-F3）,用Kp-10,U73122等单独或共同处理细胞,收集细胞上清及细胞。MTT法检测细胞活力,RIA方法检测孕酮含量,相对荧光定量PCR检测StAR、P450scc及3p-HSD mRNA表达,免疫印迹（western blot）方法检测以上蛋白表达水平。结果显示：1、Kp-10处理24 h可显著提高F1、F2/3级颗粒细胞活力（P<0.05）,并极显著增加F1、F2级卵巢颗粒细胞孕酮的分泌（P<0.01）,显著提高F3级细胞孕酮分泌（P<0.05）；可显著上调F1级颗粒细胞StAR、P450scc、3β-HSD mRNA的表达（P<0.05）,极显著上调上述三个酶在F2和F3级细胞中mRNA表达（P<0.01）；但对其蛋白含量无显著影响（P>0.05）。2、U73122对细胞活力无显著影响（P>0.05）；与对照组相比,100 nMKp-10显著增加颗粒细胞孕酮的分泌（P<0.05）；2μM U73122单独处理24 h后不影响孕酮的分泌（P>0.05）,而0.5和2μM U73122均可显著抑制Kp-10促孕酮分泌的作用（P<0.05）；与对照组相比,100 nM Kp-10及抑制剂U73122对StAR和P450sccmRNA表达无显著影响（p>0.05）,但能显著上调3β-HSD mRNA表达（P<0.05）；与100 nM处理组相比,0.5或2μM U73122均可显著下调3β-HSD mRNA表达（P<0.05）。以上结果提示：Kp-10促进鸡卵巢颗粒细胞孕酮的合成,其信号通路可能与磷脂酶C（PLC）通路有关,以及通过上调孕酮合成过程中关键酶StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达来实现的。但kisspeptin对颗粒细胞的作用可能尚存在其他通路,需要进一步的研究和探讨。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文部分缩写的中英文对照
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 禽类孕酮的合成,分泌及调节
• 1 禽类卵泡的发育
• 2 禽类孕酮的合成,分泌及调节
• 第二章 Kisspeptin生物学特征,分布及对内分泌的影响
• 1 Kisspeptin的生物学特性
• 2 Kisspeptin及受体的组织分布
• 3 Kiss-1基因的表达调控
• 4 Kisspeptin对内分泌的影响
• 5 Kisspeptin的研究进展和发展前景
• 第二篇 试验研究
• 第三章 Kisspeptin-10对鸡卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第四章 Kisspeptin-10影响颗粒细胞孕酮分泌的作用机制
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢