碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的分子生物学及其临床感染特征研究

论文摘要

细菌耐药性目前已成为全球性关注的问题,耐药细菌所致感染已构成新世纪抗感染治疗的新挑战,是当前人类健康和生命面临的主要威胁。肠杆菌科细菌分布广,与人类关系密切。在医院感染中,肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等是引起医院感染最常见的病原菌,并以多重耐药菌株引起的感染为显著特点。碳青霉烯类抗生素是目前临床治疗产超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrumβ-Lactamases, ESBLs）及AmpC酶等多重耐药菌株所引起感染的最有效的抗菌药。但随着该类抗生素在临床上的广泛应用及不合理使用,临床上已出现对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株。目前国内外关于肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制报道主要集中在四个方面：①产生碳青霉烯酶,如IMP型和VIM型金属酶以及KPC （Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC）型碳青霉烯酶等；②ESBL和/或AmpC酶过度表达同时合并外膜孔蛋白的丢失；③外排泵高表达的膜屏障机制；④药物靶位改变。在上述几种耐药机制中,产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要的机制。骆俊等人对2003年6月到2004年5月华山医院临床分离的耐亚胺培南的革兰阴性杆菌中的碳青霉烯酶进行了筛查,发现细菌产碳青霉烯酶是不动杆菌和弗劳地柠檬酸杆菌对亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因之一。沈继录等人采用琼脂稀释法测定亚胺培南和美罗培南对199株革兰阴性杆菌的最低抑菌浓度（MIC）,结果显示耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌对12种抗生素的耐药率均高于碳青霉烯类敏感革兰阴性杆菌的耐药率,而且产生多种碳青霉烯酶,如KPC、IMP、VIM和OXA型碳青霉烯酶等,并在弗劳地柠檬酸杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中有产酶克隆株的流行。在巴西,肠杆菌科细菌中对碳青霉烯耐药已成为主要问题,特别是产KPC酶的耐药株已在多个地区报道。《柳叶刀》报道的产NDM-1酶的超级细菌在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最多见,并且已传播到印度以外的国家。虽然肠杆菌科细菌可通过产生金属酶而对碳青霉烯类抗生素耐药,但此类菌株的检出率极少。自2001年报道第一株产KPC酶的肺炎克雷伯菌以来,有关碳青霉烯酶尤其是KPC酶的研究目前已成为国际关注焦点,世界各地不断出现此类菌株引起的医院感染的报告,其检出率亦呈快速上升的趋势。2005年-2008年华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南等抗菌药的耐药率均在2%以下,但2009年快速上升至13%左右；2010年更是上升为26.3%。弗劳地柠檬酸杆菌2005年对碳青霉烯类抗生素的耐药率在10%,2006年快速上升至45%左右,2007年-2009年维持在35%左右。进一步的资料分析结果显示,华山医院临床分离的对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌中,大部分菌株集中于神经外科病房和重症ICU病房。由于KPC酶基因往往位于质粒上,该质粒同时亦可携带多种对其他抗菌药耐药的基因,因此产KPC酶的菌株往往具有高度的耐药性和广泛的播散性,临床上对该类菌株引起的感染治疗是一个棘手的问题。基于此,本课题对2009年4月到2010年2月期间华山医院临床分离的82株对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌（Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, CRE）进行了分子生物学及其临床感染特征的研究,以明确本院CRE菌株的耐药现状、耐药机制、传播机制及其感染的危险因素。为针对CRE感染的抗生素合理选用提供依据,这对及时遏制CRE菌株引起的持续感染和暴发流行,降低医院感染的发生率和病死率有重要意义。本研究内容共包括以下四部分。第一部分碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的药敏试验及其同源性分析为了解华山医院肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性,我们收集了2009年4月到2010年2月的1561株肠杆菌科细菌,采用纸片扩散法对收集的菌株进行耐药谱的初步分析,并根据2010年更新版的CLSI （Clinical and Laboratory Standard Institute）文件中各类抗生素对肠杆菌科细菌药敏试验结果判定标准,显示1561株肠杆菌科细菌中肺炎克雷伯菌最常见,共检出604株（38.7%）,其中有113株CRE菌株；其次是大肠埃希菌,共检出581株,其中有12株CRE菌株。在1561株肠杆菌科细菌中,奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌各占5%左右,且18.1%的阴沟肠杆菌为CRE菌株：粘质沙雷菌、斯氏普罗威登菌、摩根摩根菌、产酸克雷伯菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌和雷氏普罗威登菌的菌株比例在1-4%之间；其余的菌株比例都在1%以下。细菌检出以呼吸道和尿路为主要来源,各占46.4%（725/1561）和34.6%（540/1561）。男性患者有862位,女性患者有673位,另有26位信息缺失。患者主要为40-80岁的中老年人,占59.4%（927/1561）。按照2009年版CLSI文件标准,除个别菌株保存不佳外,细菌经分离纯化培养,最后共收集有82株CRE菌株作为本组受试菌株,包括68株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae、KPN）、3株大肠埃希菌（Escherichia coli、ECO）、3株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae、ECL）4株弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii、CFR）、1株产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes、EAE）、1株斯氏普罗威登菌（Providencia stuartii、PST）、1株丙二酸盐柠檬酸杆菌（Citrobacter malonate、CML）和1株产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca、KOX）。采用琼脂对倍稀释法测定包括厄他培南、美罗培南和亚胺培南3种碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类等16种抗生素对82株CRE菌株的MIC,除了黏菌素和替加环素判断标准按BSAC （British Society for Antimicrobial Chemotherapy criteria, version9.1,March 2010）外,其余MIC结果按2010年更新版CLSI文件标准。以下研究的受试菌株均为82株CRE菌株。药敏试验结果显示,82株CRE菌株中68株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌对头孢他啶,头孢噻肟,头孢吡肟,氨曲南以及厄他培南的耐药率为100%；对两种酶抑制剂复方制剂（头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他巴唑坦）的耐药率均为95%左右；对亚胺培南和美罗培南的耐药率为90%左右；对阿米卡星和环丙沙星的耐药率分别为85.3%和97.1%。68株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌中有70%的菌株对磷霉素和多西环素敏感；对黏菌素、米诺环素和替加环素的耐药率相对较低；分别为2.9%,7.4%和13.2%。14株其他CRE菌株对环丙沙星和厄他培南全耐药；对两种酶抑制剂复方制剂以及头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南的耐药率均为92.3%；84.6%的菌株对头孢吡肟和阿米卡星耐药；对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为76.9%和61.5%；近70%的菌株对磷霉素耐药；近60%的菌株对多西环素耐药；对黏菌素、米诺环素和替加环素耐药率分别为15.4%,38.5%和23.1%。16种抗生素中,黏菌素和替加环素对82株CRE菌株的抗菌活性比较高,以2μg/mL和4μg/mL的浓度可以抑制90%的细菌。82株CRE菌株对碳青霉烯类和头孢菌素类抗生素表现出高度耐药水平,如亚胺培南、美罗培南、厄他培南对82株CRE菌株的MIC50/MIC90的值分别是32/64μg/mL,64/128μg/mL和128/256μg/mL。对碳青霉烯类抗生素全耐药的细菌有68株,其中60株为肺炎克雷伯菌。头孢菌素类抗生素对82株CRE菌株的MIC90值均≥256μg/mL。本组受试的82株CRE均为多重耐药株,其中泛耐药菌株有54株（65.9%,54/82）。此外,对68株碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌株的药敏试验结果显示,碳青霉烯类抗生素联合酶抑制剂克拉维酸或EDTA后,碳青霉烯类抗生素的抗菌活性几乎没有改变,但碳青霉烯类抗生素联合3-氨基苯硼酸的抗菌活性有所提高,联合3-氨基苯硼酸后的亚胺培南、美罗培南、厄他培南对68株CRE肺炎克雷伯菌的MIC50/MIC90分别为1/1μg/mL,4/4μg/mL和8/8μg/mL,与单药相比分别下降为单药的1/32到1/64,特别是亚胺培南联合3-氨基苯硼酸对细菌的作用特别强。碳青霉烯类抗生素联合3-氨基苯硼酸后,对14株其他CRE菌株的抑菌作用也很明显。碳青霉烯类抗生素联合外排泵抑制剂MC207110对68株CRE肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性无影响,而对14株其他CRE菌株的MIC50值显示有升高。对68株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的PFGE分型,采用Quantity One图像分析软件,可分为18个型别。3个主要型别分别是J型（14株,20.6%）、N型（12株,17.6%）和R型（12株,17.6%）。其余如Q型6株,Ⅰ型5株,D型4株,G、H和P型各有2株,A、B、C、E、F、K、L、M和O型各一株。MLST分型显示,优势的克隆株为ST-11型,有57株（83.8%）,其他的有ST-350型2株,ST-16, ST-22, ST-23, ST-27, ST-107, ST-148, ST-477, ST-494和ST-544型别各一株。PFGE的3种主要型别均属于ST-11型。本组资料提示：①碳青霉烯类耐药株大多为泛耐药株（65.9%,54/82）。②黏菌素和替加环素具有体外抗CRE菌株的活性。③碳青霉烯类联合3-氨基苯硼酸对CRE菌株具有良好的抗菌活性；碳青霉烯类抗生素和外排泵抑制剂MC207110的联合,未见碳青霉烯类抗生素对碳青霉烯类耐药株的MICs降低；④本组受试细菌存在3个主要克隆流行株,即J型（14株,20.6%）、N型（12株,17.6%）和R型（12株,17.6%）。ST-11为主要优势型别占83.8%（57/68）。PFGE分型中的主要型别J、N和R型都属于ST-11。第二部分CRE菌株中碳青霉烯酶及β-内酰胺酶基因型的分析本研究采用改良Hodge试验（MHT）和3-氨基苯硼酸检测法进行碳青霉烯酶表型的检测。MHT对82株CRE的碳青霉烯酶的检出菌株数为67株。以PCR方法为金标准,改良Hodge试验对82株CRE的碳青霉烯酶的检出敏感性和特异性分别是89.9%（62/69）和61.5%（8/13）。假阳性率和假阴性率分别为7.2%（5/69）和53.8%（7/13）。3-氨基苯硼酸抑制实验检测82株CRE中产碳青霉烯酶的菌株有70株,与PCR方法相比较,其灵敏度和特异性分别为92.7%（64/69）和53.8%（7/13）；假阳性率和假阴性率分别为8.8%（6/69）和38.5%（5/13）。改良Hodge试验以及3-氨基苯硼酸2种方法对CRE肠杆菌科细菌中产碳青霉烯酶的检出率分别与PCR方法相比较,并作统计学处理,显示差异无统计学意义（P>0.05）.EDTA协同碳青霉烯类抗生素检测金属酶结果显示82株CRE菌株中未检测到细菌产金属酶。目前,检测KPC型碳青霉烯酶等耐药基因的金标准仍是通过PCR扩增编码KPC酶的耐药基因并配合DNA测序分析,以明确KPC酶的型别。我们采用PCR扩增技术对82株CRE菌株中的碳青霉烯酶基因进行扩增,并作DNA测序,结果显示,在肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和产气肠杆菌菌种中都检出到产KPC酶的菌株。84.1%（69/82）的CRE菌株产生KPC型碳青霉烯酶酶,2株同时产OXA-69like型碳青霉烯酶。未检测到产金属β-内酰胺酶的菌株。此外,采用PCR扩增技术对82株CRE菌中包括ESBLs和质粒AmpC酶基因在内的β-内酰胺酶基因进行扩增和作DNA测序分析,结果显示编码ESBLs酶的基因在CRE细菌中普遍存在。其中产CTX-M型ESBLs酶的菌株有74株（90.2％）:SHV-12型ESBLs酶有33株（40.2%）,1株产SHV-31型ESBL.6株CRE细菌产质粒介导的AmpC酶,占7.3%（6/82）,均为DHA-1型酶基因。产OXA-1、OXA一2和OXA-10等超广谱酶的细菌各检出1株；产TEM-1广谱酶的细菌占35.4%（29/82）。上述69株产KPC酶的CRE菌株中,仅1株细菌为单产KPC酶,其余67株合并产ESBL酶,另有1株合并产AmpC型酶。为了解临床分离的CRE细菌中编码的KPC酶基因是否可在不同种属的细菌间进行传播,我们对4株同时产KPC-2酶和CTX-M型ESBL或DHA-1酶的CRE菌株（弗劳地柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯菌各2株）进行了接合转移试验。受体菌为大肠埃希菌J53（对叠氮钠耐药）和EC600（对利福平耐药）。结果显示,2株弗劳地柠檬酸杆菌分别将耐药质粒转移接合到了受体菌大肠埃希菌J53和EC600。KPC酶基因的PCR扩增和耐药表型测定转移接合子均和供体细菌一致。抽提供体菌CRE-3180和相应的大肠埃希菌J53的接合子中的质粒,对其进行了地高辛标记的检测KPC基因的southern杂交试验,结果显示,转移到接合子中的质粒携带KPC基因,质粒大小为23kb左右。而以EC600为受体菌的3株接合子中均检测到3条质粒,经过southern杂交试验证实,3条质粒均带有KPC基因。质粒大小不等,除一条为23kb左右外,其余两条在23kb以上。本研究采用PCR方法对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在CRE菌中的分布及其携带的耐药基因盒进行了分析,结果显示68株CRE肺炎克雷伯菌株中Ⅰ类整合子和Ⅱ类整合子的检出率分别为55.9%（38/68）和4.4%（3/68）。其余14株CRE菌株的Ⅰ类整合子和Ⅱ类整合子的检出率分别为78.5%（11/14）和7.1%（1/14）。未见Ⅲ类整合子检出。Ⅰ类整合子阳性的细菌中有91.8%（45/49）的菌株为产KPC酶株且同时合并产ESBL内酰胺酶,其中肺炎克雷伯菌占了73.4%（36/49）。Ⅱ类整合子阳性的细菌中产KPC酶的菌株有3株,且均为肺炎克雷伯菌。同时兼有两类整合子检出的细菌有2株,均为产KPC酶的肺炎克雷伯菌。PCR扩增整合子可变区的序列,可以得到3种大小不同的片段,分别约为250bp,750bp和1000bp。可变区序列用Hinf 1酶切后得到3组不同的片段。对PCR阳性结果的可变区序列进行测序,除了编码氨基糖苷类钝化酶基因aac（3）-Ⅰ外,未发现其他耐药基因盒。本组资料结果提示：①KPC-2型碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要机制之一。②KPC-2基因可由质粒携带,并可在不同的细菌种属间进行转移播散。③Ⅰ类整合子在本试验菌株中检出率高（59.7％,49/82）.④改良Hodge试验和3-氨基苯硼酸抑制试验检测肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的灵敏度高；与PCR方法比较,上述两种方法对CRE肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检出率差异无统计学意义。第三部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的外膜孔蛋白分析采用外膜孔蛋白SDS-PAGE电泳对82株CRE菌株的外膜孔蛋白进行分析,结果显示,22株CRE菌株存在OmpK35或其同源膜孔蛋白（如OmpC）的下调,其中17株为肺炎克雷伯菌：有22株存在OmpK35或其同源膜孔蛋白的缺失,其中15株为肺炎克雷伯菌；OmpK35或其同源膜孔蛋白正常的为38株CRE,其中36株为肺炎克雷伯菌。10株CRE菌株存在OmpK36或其同源膜孔蛋白（如OmpF）的下调,其中5株为肺炎克雷伯菌；有57株存在OmpK36或其同源膜孔蛋白的缺失,其中48株为肺炎克雷伯菌；OmpK36或其同源膜孔蛋白正常的为15株CRE,全部为肺炎克雷伯菌。同时有OmpK35和OmpK36或其同源膜孔蛋白缺失的有12株,其中9株为肺炎克雷伯菌。65.8%（54/82）的肺炎克雷伯菌株缺失OmpK35和OmpK36中的1条或者两条都缺失,两种膜孔蛋白表达都正常的有12株,全部为肺炎克雷伯菌。从膜孔蛋白角度看,OmpK36蛋白缺失的菌株占多数,肺炎克雷伯菌中有48株,14株其他CRE菌株中有9株。本组试验显示细菌膜孔蛋白的缺失或下调表达也是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类产生耐药的机制之一。第四部分产KPC酶的CRE菌株感染患者的临床感染特征及危险因素为了解CRE菌株感染或定植患者的临床感染特征及感染的危险因素,我们对本研究中68份保存完整的病史资料进行了回顾性的调查分析,同时以同期85份临床分离的对碳青霉烯类抗生素敏感的菌株（CSE）检出患者的病史资料作为对照,剔除或者不剔除定植菌株的患者资料,分析CRE和CSE菌株感染患者的临床特征,然后剔除其他菌株,分析产KPC酶的肺炎克雷伯菌感染患者（非产KPC酶组分为两种情况：CRE组非产KPC酶+CSE非产KPC酶株感染的患者、CSE非产KPC酶株感染的患者）的潜在危险因素。结果显示,CRE菌株感染患者的总住院天数平均值为49.55±36.91天,有56（96.6%）位患者为院内感染,2（3.4%）位患者为院外感染。住院期间有一次或以上手术者占37.9%（22/58）。有63.8%（37/58）的患者住院期间更换床位一次或以上,15.5%（9/58）的患者住院期间更换床位三次及以上。除2位患者没有创伤性操作外,其余都有过创伤性的操作如气管切开、深浅静脉穿刺、腰穿和/或引流等。分别有94.8%（55/58）、53.4%（31/58）的患者使用过导尿管和接受机械通气；住院期间,抗菌药物的使用情况如下：使用碳青霉烯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢菌素类和其他类别抗生素（如四环素类、抗结核药物、恶唑烷酮类、磷霉素类、抗真菌类和万古霉素类等）的患者数分别占70.7%（41/58）、35.3% （24/58）、39.7%（23/58）、43.1%（25/58）和75.9%（44/58）。58位患者用于治疗疾病的总费用平均值为4.08×106±1.74×105元。除6位患者死亡,4位患者未愈之外,其余都有好转或治愈。单因素分析CRE菌株感染患者的临床特征,提示医院感染、碳青霉烯类应用、侵袭性操作、手术、床位更换、氨基糖苷类应用、基础疾病、神经外科和ICU病房的差异是有统计学意义的。多因素分析医院感染是CRE菌株感染患者的独立危险因素。单因素分析产KPC酶肺炎克雷伯菌感染的危险因素包括医院感染、碳青霉烯类应用、侵袭性操作、神经外科和ICU病房。多因素分析显示,其中医院感染、神经外科和ICU病房是产KPC酶肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素。本组资料提示：①碳青霉烯类和头孢菌素类抗生素在临床感染治疗中使用频繁；②医院感染是CRE菌株感染患者的独立危险因素。医院感染、神经外科和ICU病房是产KPC酶肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素;③临床应加强CRE菌株的监测并采取行之有效的医院感染控制措施限制CRE菌株的进一步播散,例如对检出CRE菌株感染或定植患者的床旁隔离；医护人员良好的手卫生习惯；限制频繁的病床更换；合理应用碳青霉烯类抗生素等。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 本文缩略词
• 前言
• 本研究的技术路线图
• 第一部分 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的药敏试验及其同源性分析
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二部分 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶和β内酰胺酶基因研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第三部分 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的外膜孔蛋白分析
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第四部分 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌感染患者临床资料分析
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 全文讨论
• 全文小结
• 在学期间发表的文章
• 创新点和展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢