陆地棉类膨胀素基因的克隆与功能初步研究

论文摘要

细胞壁是植物细胞区别于动物细胞最显著的特征,自1665年胡克观察到软木切片中的细胞壁后它就一直受到科学家们的关注。植物细胞壁在细胞生长、分化、分裂和死亡等过程发挥重要功能,并对植物的许多生长发育过程进行调控；其功能主要表现在机械支持、物质运输、防御反应、细胞识别等方面,这些功能依赖于细胞壁内的多种壁蛋白而存在膨胀素蛋白是一类多基因超大家族编码的细胞壁蛋白,依其自身结构分可为α-expansin （EXPA）,β-expansin（EXPB）, expansin-like A （EXLA）和expansin-like B （EXLB）四个亚族。目前,对膨胀素蛋白的研究主要集中在EXPA和EXPB两个亚族,且仅限于拟南芥、番茄、玉米、水稻等少数几个物种。众多研究表明,膨胀素蛋白参与多个植物生长发育过程,如：细胞生长、叶原基产生、花粉管渗入、果实成熟、细胞壁降解、种子生长和萌发等,而且还对淹水、光照、盐和激素等处理产生相应的反应。基于棉花原生质体再生细胞壁的差减文库、cDNA末端快速扩增（RACE）技术及同源序列扩增的方法,我们从陆地棉（Gossypium hirsutum）中分离到四个膨胀素基因。序列比对发现这四个基因与GenBank中注册的类膨胀素基因具有高度的同源性。据此推测它们是类膨胀素基因亚族成员,并命名为GhEXLA1、GhEXLA2、GhEXLB1和GhEXLB2。对陆地棉类膨胀素基因GhEXLA1、GhEXLA2、GhEXLB1和GhEXLB2的表达量进行分析,结果发现：类膨胀素基因在陆地棉原生质体再生细胞壁过程中特异高量表达；陆地棉根、茎、叶中类膨胀素基因表达量相对较低,特别是GhEXLB1;除GhEXLB2在合子胚中的表达量较高外,类膨胀素基因在各种状态的胚及愈伤中的表达量相对较低。为了研究类膨胀素基因陆地棉中的功能,针对每个类膨胀素基因分别构建超量表达载体（pCAMBIA2300S）和干涉表达载体（pHELLSGATE4）。用农杆菌介导这些载体转化陆地棉豫早1号下胚轴和珂字201愈伤,获得足够多的转基因植株和单细胞系。对获得的转基因再生植株和单细胞系数目进行统计,发现：外源类膨胀素基因（或片段）的转入严重影响陆地棉植株及胚性愈伤的再生,特别是GhEXLA1和GhEXLB1;转入不同载体后获得再生植株或单细胞系数目差异较大。转基因植株和转基因单细胞系经过DNA水平、RNA水平或Southern blot检测后,挑选阳性转基因材料进行后续分析。首先,获得阳性转基因植株15株,其中转化GhEXLA2干涉表达载体的有4株,转化GhEXLB2超量表达载体的有4株,转化GhEXLB2干涉表达载体的有7株。将所有转基因植株的幼叶和幼茎制作组织石蜡切片。对所获组织石蜡切片进行细致的分析,发现转基因单株幼叶和幼茎中的细胞大小及组织结构未发生明显变化,说明类膨胀素基因在陆地棉中并不具备是细胞壁伸展和细胞膨胀的功能。其次,获得转基因单细胞系若干,其中转化GhEXLBl超量表达载体未获得转基因单细胞系,每个载体挑选1个转基因单细胞系用于再生细胞壁分析。分离转基因单细胞系原生质体,并将分离的原生质体进行细胞壁再生培养,取培养0h、12h、24h、48h和72h的培养物经Calcofluor White M2R染色后观察,统计壁再生系数。分析统计数据发现：与对照相比,无论转入何种载体,都会降低原生质体细胞壁再生速度；就转基因单细胞系而言,转化GhEXLB2相关载体原生质体再生细胞壁速度最快,其次是转化GhEXLA2相关载体的。总之,改变类膨胀素基因在陆地棉中的表达会影响外植体再生植株的能力、愈伤再生单细胞系的能力和原生质体再生细胞壁的能力；而本研究并未发现陆地棉类膨胀素基因具有传统的使细胞壁伸展和细胞膨胀的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 植物细胞壁研究进展
• 1.1.1 植物细胞壁的成分
• 1.1.2 植物细胞壁的结构
• 1.1.3 植物细胞壁的形成
• 1.1.4 植物细胞壁的功能
• 1.2 植物膨胀素研究进展
• 1.2.1 植物膨胀素的结构
• 1.2.2 植物膨胀素的分类
• 1.2.3 膨胀素活性特征及生物化学特性
• 1.2.4 植物膨胀素的功能
• 1.2.5 植物膨胀素基因的表达
• 1.2.6 膨胀素作用机理
• 1.3 木研究的目的与意义
• 2 陆地棉类膨胀素基因的克隆及表达分析
• 2.1 材料试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA提取、纯化和第一链cDNA合成
• 2.2.2 陆地棉类膨胀素基因的克隆
• 2.2.3 陆地棉类膨胀素基因的序列分析
• 2.2.4 陆地棉类膨胀素基因表达分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 陆地棉类膨胀基因的克隆
• 2.3.2 陆地棉类膨胀素基因的序列分析
• 2.3.3 陆地棉类膨胀素基因的表达分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 利用RACE技术克隆类膨胀素基因的可行性
• 2.4.2 陆地棉类膨胀素基因是一个多基因亚家族
• 2.4.3 本研究克隆的基因属于膨胀素基因家族类膨胀素亚族
• 2.4.4 陆地棉类膨胀素基因的表达
• 3 根癌农杆菌介导类膨胀素基因转化陆地棉研究
• 3.1 材料试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株与载体
• 3.1.3 实验试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 陆地棉类膨胀素基因RNA干涉表达载体构建
• 3.2.2 陆地棉类膨胀素基因超量表达载体构建
• 3.2.3 电转化法转化农杆菌EHA105
• 3.2.4 类膨胀素基因转化YZ1下胚轴及转基因检测
• 3.2.5 类膨胀素转化C201胚性愈伤及转基因检测
• 3.2.6 转基因T0植株细胞学分析
• 3.2.7 转基因原生质体再生细胞壁分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 转基因载体PCR检测
• 3.3.2 转基因植株（单细胞系）PCR检测
• 3.3.3 转基因植株（单细胞系）表达分析
• 3.3.4 转基因阳性单株Southern blot分析
• 3.3.5 转基因植株组织切片分析
• 3.3.6 转基因单细胞系再生细胞壁分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 类膨胀素基因影响转基因植株（单细胞）及单细胞系细胞壁的再生
• 参考文献
• 附录
• 附录1 改良的异硫氰酸胍法提取总RNA、去基因组DNA和纯化
• 附录2 第一链cDNA合成程序
• 附录3 RACE-Ready cDNA制备程序
• 附录4 琼脂糖凝胶DNA回收程序
• 附录5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 附录6 PCR产物回收
• 附录7 质粒提取步骤
• 附录8 农杆菌EHA105感受态制备
• 附录9 棉花组织培养所用培养基和培养条件
• 附录10 棉花基因组DNA提取程序（大量法）
• 附录11 Southern blot程序
• 附录12 组织石蜡切片制作过程
• 附录13 陆地棉愈伤分离原生质体及再生细胞壁培养
• 致谢