硫酸铜诱导对柑橘溃疡病菌抗铜性及抗铜相关基因表达的影响

论文摘要

柑橘溃疡病（Citrus bacterial canker disease, CBCD）是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri （Hasse） Vauterin）引起的一种细菌性病害。在自然条件下,该病菌可以侵染芸香科多种植物,造成柑橘的树势衰退和果实形成溃疡斑,从而降低柑橘果品产量及质量,对我国柑橘出口和产业发展造成严重的经济损失。目前果园中大多使用硫酸铜、氢氧化铜和氯化铜等化学药剂进行防治。为明确含铜杀菌剂的长期使用对该病菌抗药性产生的影响,本研究对柑橘溃疡病菌抗铜相关基因copA和copB进行了克隆和原核表达载体的构建；测定了在室内硫酸铜选择压力下柑橘溃疡病菌抗铜性的变化,具体研究结果如下：1.以提取的柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因copA和copB进行了PCR扩增,获得了大小分别为1798 bp和1111 bp的目标片段,并对扩增产物进行了克隆；构建了这两个基因的原核表达载体（pET-copA和pET-copB）,并在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳,结果显示,约69kDa和46kDa的copA和copB特异性重组蛋白得到有效表达。利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了copA和copB的多克隆抗体。用间接ELISA法测定了所制备的copA和copB多克隆抗体的效价均为1：6400,确定了该抗体的工作浓度范围为1：2000-1：5000。同时利用制备的抗体对原核表达产物进行了western blot分析,结果显示制备的抗体可与原核表达蛋白发生特异性反应,并且纯化后的抗体非特异性条带较少。2.分析了抗铜相关基因copA和copB的诱导表达对大肠杆菌BL21（DE3）的抗铜性影响,结果显示,将构建的原核表达载体（pET-copA和pET-copB）转入大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达,对大肠杆菌的增殖有明显的抑制作用,但在含不同浓度硫酸铜的培养基中.的增殖无明显差异,表明copA和copB基因的过量表达可使大肠杆菌抗铜性维持在一定的水平。3.以4个柑橘溃疡病菌菌株为出发菌株,其硫酸铜半数致死浓度为100μg/ml,通过在硫酸铜浓度逐步提高的培养基中继代培养近1年,这些菌株对CuSO4浓度抗性明显提高,其致死浓度由原来的150μg/ml提高到270μg/ml-280μg/ml;利用制备的copA和copB的多克隆抗体,对9号菌株的出发菌株和耐铜菌株中copA和copB基因的表达进行western blot分析,结果显示在100μg/ml CuSO4诱导及非CuSO4诱导条件下,抗铜基因copA均可有效表达,且在无CuSO4诱导时出发菌株和耐铜菌株copA的表达量无明显差异,而耐铜菌株在CuSO4诱导下copA的表达量相对增加；但在CuSO4诱导及非诱导条件下均未能检测到抗铜基因copB的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 柑橘溃疡病的发生特点及防治研究进展
• 1.1.1 柑橘溃疡病的地理分布
• 1.1.2 柑橘溃疡病菌的寄主植物及危害症状表现
• 1.1.2.1 柑橘溃疡病菌的寄主植物
• 1.1.2.2 柑橘溃疡病的危害及症状表现
• 1.1.3 柑橘溃疡病的发生规律及影响因子
• 1.1.4 柑橘溃疡病的防治措施研究进展
• 1.2 病原的菌系分化特点及分子生物学特性研究进展
• 1.2.1 柑橘溃疡病菌的菌系分化
• 1.2.2 柑橘溃疡病菌的基因组结构
• 1.3 细菌抗铜机理的研究进展
• 1.3.1 希氏肠球菌（Enterococcus hirae）抗铜机理的研究进展
• 1.3.2 大肠杆菌(Escherichia coin抗铜机理的研究进展
• 1.3.3 植物病原细菌的抗铜机理研究进展
• 1.4 研究目的与意义
• 第二章 抗铜相关基因copA和copB克隆及原核表达蛋白抗体的制备
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株和主要试剂
• 2.1.2 引物设计
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 抗铜相关基因copA和copB的克隆
• 2.2.1.1 柑橘溃疡病菌DNA的抽提
• 2.2.1.2 抗铜相关基因copA和copB的PCR扩增
• 2.2.1.3 PCR产物的琼脂糖电泳检测
• 2.2.1.4 目标片段的纯化回收
• 2.2.1.5 目标片段与克隆载体（pMD18-T载体）的连接
• 2.2.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.1.7 热击转化大肠杆菌感受态细胞DH5α
• 2.2.1.8 SDS裂解法小量抽提质粒DNA
• 2.2.1.9 质粒的双酶切鉴定
• 2.2.1.10 序列测定与分析
• 2.2.2 抗铜相关基因copA和copB原核表达
• 2.2.2.1 抗铜相关基因copA和copB原核表达载体的构建
• 2.2.2.2 抗铜相关基因copA和copB在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 2.2.3 抗铜相关基因copA和copB原核表达蛋白的大量制备及定量
• 2.2.4 抗铜相关基因copA和copB原核表达蛋白抗体的制备
• 2.2.5 抗铜相关基因copA和copB抗血清效价的测定
• 2.2.6 蛋白质印迹分析
• 2.2.7 抗体的纯化
• 2.2.8 copA和copB原核表达产物对大肠杆菌抗铜性的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 抗铜相关基因copA和copB的克隆
• 2.3.1.1 抗铜相关基因copA和copB的PCR扩增及目标片段的回收
• 2.3.1.2 抗铜相关基因copA和copB的克隆及酶切鉴定
• 2.3.2 测序结果分析
• 2.3.3 抗铜相关基因copA和copB原核表达
• 2.3.3.1 原核表达载体的构建及重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.3.2 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.3.3.3 原核表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.3.4 抗铜相关基因copA和copB原核表达蛋白的回收及浓度测定
• 2.3.4 copA和copB原核表达蛋白抗血清效价的测定结果
• 2.3.5 copA和copB原核表达蛋白的Western blot分析
• 2.3.6 copA和copB基因原核表达产物对大肠杆菌抗铜性的影响
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 硫酸铜胁迫对柑橘溃疡病菌耐铜性的影响
• 3.1 材料和主要试剂
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 硫酸铜对柑橘溃疡病菌的半数致死浓度的测定
• 3.2.2 柑橘溃疡病菌耐铜菌株的筛选
• 3.2.3 耐铜菌株的western blot分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 硫酸铜对柑橘溃疡病菌的半数致死浓度的测定结果
• 3.3.2 柑橘溃疡病菌耐铜菌株的筛选
• 3.3.3 耐铜菌株的western blot分析
• 3.4 小结与讨论
• 参考文献
• 附录:主要试剂、溶液的配制及测序结果
• 致谢