电针结合淫羊藿总黄酮对外源性皮质酮引起大鼠海马损伤的影响及机制

论文摘要

电针结合淫羊藿总黄酮对外源性皮质酮引起大鼠海马损伤的影响及机制糖皮质激素（GCs）为体内最重要的激素之一，正常浓度下不仅对于维持机体正常的生长发育以及生理状态下内环境的稳定极为重要，而且又是很强的免疫抑制剂，参与体内多种代谢过程和中枢神经系统功能的调节。在各种应激状态下（如创伤、烧伤、手术、脑血管意外等）体内GCs大量分泌，以适应病理生理状态下的急需。但是，长期反复的应激会使血浆中GCs维持在高水平，或者外源性长期持续给予皮质酮（corticosterone）时可反馈抑制HPA轴的功能，在整体可导致机体衰老样的变化，如精神不振、记忆力下降等；引起中枢神经系统功能紊乱，海马结构的可塑性变化，海马神经元萎缩、丢失甚至死亡。众所周知，胶质细胞与神经元之间有着广泛的信息传递，在神经元的发生、存活和死亡过程中起着重要的作用。而异常水平的糖皮质激素也可以影响到胶质细胞特别是星形胶质细胞的活化情况。但是皮质酮诱发神经元死亡的分子机制，以及星形胶质细胞在这一过程中的作用到目前还不完全明了。肾阳虚是中医理论中极为重要的病理生理概念之一，肾阳虚证在HPA轴中表现为不同层次、不同程度的功能紊乱。针刺在中医临床上是一种非药物的重要治疗方法，对中枢神经系统具有广泛的调节效应。另外，淫羊藿总黄酮（EF）是补肾中药淫羊藿的提取成份，近年来关于EF的药理研究表明，EF对心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统等均有作用。本文在整体动物上，采用给大鼠皮下注射皮质酮模型，观察HPA轴的抑制情况，海马结构可塑性的变化，星形胶质细胞的活化以及神经生长因子NGF表达变化；同时探讨电针、EF及电针和EF合用对皮质酮所引起上述指标变化的影响。在离体细胞培养模型上采用海马神经元和星形胶质细胞的原代培养，观察皮质酮对星形胶质细胞和神经元的影响；观察在星形胶质细胞条件培养中皮质酮诱发的神经元TUNEL标记，及ERK1／2和（PI3-K）／Akt信号通路活化等变化，探讨在皮质酮诱发海马神经元损伤过程中胶质细胞保护作用及机制。一、整体实验在整体实验，大鼠随机分为五组：正常组（NORM）、皮质酮组（CORT）、电针组（EA）、淫羊藿总黄酮组（EF）、针药结合组（EA+EF）。CORT组于每天上午7:30-9:30按10mg／kg体重皮下注射皮质酮（CORT），每天一次，持续两周；EA组在皮下注射皮质酮一小时后给予电针治疗，取“肾俞”和“关元”穴，用30#美容细针直刺5mm，捻转后接G6805电针仪刺激30分钟，疏密波，频率10Hz，强度1-2mA，以双下肢轻微颤动为度，电针从实验开始的第一天开始，隔天一次；EF组按0.06g／（kg.d）给予淫羊藿总黄酮灌胃，每天一次，持续两周；EA+EF组在给予皮质酮皮下注射和淫羊藿总黄酮灌胃一小时后给予电针治疗，皮质酮和淫羊藿总黄酮的用法及用量分别同CORT组和EF组，而电针治疗时间与次数与FA组相同。结果显示：1．大鼠一般状况比较实验前各组之间大鼠体重无显著性差异，实验过程中NORM组大鼠体重渐增，反应灵敏，活动及饮食正常，体毛浓密、柔顺而有光泽。CORT组在实验第七天左右出现明显的萎靡不振的病理征象（食少，蜷缩拱背，少动，毛不光洁），实验结束时体重未见明显增加；EA组实验结束后一般情况不佳，体重虽略有增加，但与治疗前比较无明显差异。而EF组和EF+EA组体重明显增加。2．各组大鼠相关脏器重量变化情况的比较治疗结束后，与NORM组相比，CORT组大鼠垂体、肾上腺，胸腺重量显著降低，提示皮质酮组大鼠存在下丘脑-垂体-肾上腺轴及免疫器官（胸腺）的组织萎缩及功能下降；与CORT组比较，EA组有上升趋势，但尚无统计学差异。而EF组和EF+EA组大鼠垂体、肾上腺，胸腺重量明显增加；提示EF组和EF+EA组大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴、免疫器官的功能有不同程度的恢复。3．各组大鼠下丘脑中CRH和血浆中ACTH含量变化的比较连续14天皮下注射CORT后，CORT组大鼠血浆ACTH和下丘脑中CRH含量明显降低；EA组大鼠血浆ACTH的含量明显回升，与CORT组相比有统计意义，下丘脑中CRH含量也有所回升，但与CORT组相比较无统计意义。而EF组和EF+EA组大鼠血浆ACTH和下丘脑中CRH浓度均显著高于CORT组。提示电针和淫羊藿总黄酮均可以减轻外源性给予皮质酮引起下丘脑-垂体-肾上腺的抑制状态，针药结合的疗效优于单纯的针刺和淫羊藿总黄酮治疗。4．各组大鼠海马中GFAP表达的变化胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein；GFAP）是在星形胶质细胞中特异性表达的一个标志性蛋白，GFAP表达的多少与星形胶质细胞的增殖及功能状态有密切的关系。免疫组化结果表明，CORT组大鼠海马中GFAP的表达显著降低，而给予电针治疗后，GFAP的表达增加，但无显著性差异。EF组和EF+EA组大鼠海马中GFAP的表达显著增加，且EF+EA组的增加幅度大于EF组。用Western blot和RT-PCR的方法分别观察了海马中GFAP表达及其mRNA水平的变化，结果与免疫组化的结果一致。提示淫羊藿总黄酮可以逆转皮质酮对GFAP表达的抑制，且电针可以进一步加强淫羊藿总黄酮的作用效果。5．各组大鼠海马中NGF表达的变化神经生长因子（nerve growth factor；NGF）是一种影响神经细胞发育、存活的多能神经营养因子，不仅作用于周围神经系统，而且有明显的中枢效应。免疫组化结果表明，CORT组大鼠海马中NGF的表达显著降低，而给予电针治疗后，NGF的表达明显增加。EF组和EF+EA组大鼠海马中NGF的表达进一步增加，且EF+EA组的增加幅度大于EA和EF组。用Western blot和RT-PCR的方法分别观察了海马中NGF表达及其mRNA水平的变化，结果与免疫组化的结果一致。提示皮质酮可以降低海马中NGF的表达水平，电针和淫羊藿总黄酮治疗均可对抗皮质酮对NGF表达的抑制，且两者合用可协同促进海马中NGF的表达。6．各组大鼠海马中TUNEL标记的变化脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP刻痕末端标记（TUNEL）法主要用来检测细胞DNA损伤情况。TUNEL标记结果显示，CORT组大鼠海马齿状回中TUNEL标记显著增加；与CORT组相比，EA组和EF组大鼠海马齿状回中TUNEL标记显著减少，在EF+EA组大鼠海马齿状回中TUNEL标记进一步减少。结果显示高浓度皮质酮可以诱发海马神经元死亡；电针和淫羊藿总黄酮均对海马神经元具有保护作用，能减弱皮质酮对海马神经元的损伤，而两者对海马神经元的保护具有协同作用。7．各组大鼠海马结构可塑性的变化多唾液酸-神经细胞粘附分子（Polysialic acid-neural cell adhesion molecule；PSA-NCAM），是一种特殊的神经细胞粘附分子，参与神经细胞粘附和轴突生长、并促进突触可塑性，对神经元前体细胞的迁移有重要作用，与神经元的增殖、迁移、分化等也有密切的关系。BrdU和PSA-NCAM免疫组化结果显示，在CORT组大鼠海马的齿状回，BrdU和PSA-NCAM的荧光染色显著减少；提示高浓度的皮质酮可以影响到海马结构的可塑性，抑制海马中细胞的增殖和神经元前体中PSA-NCAM的生成；与CORT组相比，EA组和EF组大鼠海马齿状回中BrdU和PSA-NCAM的荧光标记显著增加；在EF+EA组，大鼠海马齿状回中BrdU和PSA-NCAM的荧光标进一步增加。结果提示电针和淫羊藿总黄酮均可对抗皮质酮对海马中细胞的增殖和PSA-NCAM表达的抑制，且两者合用具有协同作用。二、离体实验在离体实验，通过海马神经元和星形胶质细胞的原代培养，目的在于探讨皮质酮对海马神经元损伤的分子机制及星形胶质细胞条件性培养液对皮质酮引起神经元损伤的保护作用及机制。结果表明：1．皮质酮对培养的海马神经元和星形胶质细胞的影响神经丝（neurofilament，NF）是在成熟神经元中特异性表达的一个标记分子，而星形胶质细胞特异性地表达胶原纤维酸性蛋白（GFAP），GFAP表达的多少是星形胶质细胞活化的一个主要标志。通过分别对NF和GFAP的标记，可以观察皮质酮对培养的海马神经元和星形胶质细胞形态的影响。结果显示，皮质酮抑制神经元的突起的发生；也显著抑制胶质细胞中GFAP的表达，提示皮质酮可以抑制星形胶质细胞的活化。2．在不同的培养条件下皮质酮对培养的海马神经元TUNEL标记的影响为了比较容易的观察皮质酮在导致海马神经元损伤过程中星形胶质细胞的保护作用，用无血清培养液和星形胶质细胞条件性培养液（astrocyte-conditioned medium；ACM）分别培养海马神经元，并通过TUNEL标记观察在不同的培养条件下皮质酮对海马神经元损伤的程度，结果显示，在无血清培养液中，皮质酮可引起大量的TUNEL标记的阳性细胞，并呈剂量依赖性；而在星形胶质细胞条件性培养液中，皮质酮导致的TUNEL标记阳性的细胞显著减少。本结果提示，星形胶质细胞条件性培养液具有较强的抵抗皮质酮对海马神经元的损伤。3．在不同培养条件下皮质酮对培养的海马神经元ERK1／2和Akt信号通路的影响皮质酮可以促进神经元Erk1／2和（PI3-K）／Akt的磷酸化水平，在无血清培养条件下，神经元Akt在皮质酮加入12小时时磷酸化水平最高，到24小时时恢复到原来的水平；而在星形胶质细胞条件培养液培养的神经元Erk1／2和（PI3-K）／Akt的磷酸化水平进一步显著增加，且Akt磷酸化水平增加的时程也发生变化，在皮质加入6小时磷酸化水平达到最高；提示在皮质酮导致神经元损伤过程中，ERK1／2和Akt两条信号通路均被活化，但在星形胶质细胞条件性培养液培养的神经元，ERK1／2和Akt两条信号通路的显著活化也许与神经元抗皮质酮损伤的能力增强有关。4．ERK1／2和Akt的特异性抑制剂分别在不同的培养条件下对皮质酮引起培养的海马神经元TUNEL标记的影响为了进一步确定在星形胶质细胞条件性培养液的培养条件下，是ERK1／2还是Akt信号通路与神经元具有较强的抵抗皮质酮的损伤有关，在不同的培养条件下加入ERK1／2的特异性拮抗剂U0126和Akt的特异性拮抗剂LY294002，阻断信号通路ERK1／2或者Akt的活化，观察TUNEL标记的阳性细胞的变化。结果显示：在无血清培养条件下，U0126和LY294002分别阻断信号通路ERK1／2和Akt后，TUNEL标记显著增加；而在星形胶质细胞条件性培养液中培养的神经元，U0126阻断信号通路ERK1／2后，TUNEL标记无显著变化，LY294002阻断信号通路Akt后，TUNEL标记明显增加。提示培养在星形胶质细胞条件性培养液中的神经元，在获得抵抗皮质酮引起的损伤能力过程中，与信号通路Akt的活化有密切的关系。5．在不同的培养条件下皮质酮对培养的海马神经元Bcl-2表达的影响在皮质酮导致海马神经元损伤的过程中，我们还用Western blot的方法检测在无血清培养液和星形胶质细胞条件性培养液中培养的神经元中抗凋亡因子Bcl-2表达变化的情况。结果显示，在星形胶质细胞条件性培养液中培养的神经元，皮质酮作用6h时也出现明显的Bcl-2表达水平增加，而在无血清培养液培养的神经元，皮质酮对Bcl-2的表达水平没有明显影响。鉴于Bcl-2在细胞抗凋亡的过程中发挥着重要的作用，提示Bcl-2表达水平的增加可能与在星形胶质细胞条件性培养液中培养的神经元具有较强的抵抗皮质酮引起的损伤有关。综上所述，本研究提示：1．电针或者淫羊藿总黄酮能在不同程度上改善外源性糖皮质激素对HPA轴功能状态的抑制，增加下丘脑组织中CRH和血浆中ACTH的水平。2．皮质酮大鼠海马中细胞的增殖、PSA-NCAM、GFAP和NGF表达显著降低，在给予皮质酮的同时给予电针或者淫羊藿总黄酮可以有效的可以有效的促进细胞的增殖减弱皮质酮对PSA-NCAM、GFAP和NGF表达的抑制。提示电针和淫羊藿总黄酮对皮质酮引起的海马结构可塑性变化有显著的改善作用。3．皮质酮大鼠海马齿状回TUNEL标记的阳性细胞数显著增加，在给予皮质酮的同时给予电针或者淫羊藿总黄酮后，海马中的TUNEL标记的阳性细胞数明显减少，提示电针和淫羊藿对皮质酮引起的海马损伤有一定的保护作用。4．针药合用有一定的协同作用，提示针药结合可能是提高疗效的一种方法。5．在星形胶质细胞条件性培养液（ACM）中培养的神经元对皮质酮所引起的损伤明显减弱，且CAM保护培养的海马神经元免受皮质酮的伤害有可能是通过信号通路（PI3-K）／Akt的活化，并增加了抗凋亡因子Bcl-2的表达水平。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献:
• 第一部分 电针结合淫羊藿总黄酮对外源性皮质酮引起大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献:
• 第二部分 电针结合淫羊藿总黄酮对外源性皮质酮引起大鼠海马损伤的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献:
• 第三部分 皮质酮对在星形胶质细胞条件性培养液中培养的大鼠海马神经元影响的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4.讨论
• 5.小结
• 参考文献
• 总结
• 致谢
• 附录一 溶液配制
• 附录二 研究生期间已投稿论文和参加的学术会议
• 附录三 在海马神经元退化和再生过程中糖皮质激素及胶质细胞的作用（综述）