促红细胞生成素对视网膜光损伤的防护作用及机制

论文摘要

目的:观察玻璃体腔单次注射重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜光损伤诱导的视网膜变性的防护作用及其机制。方法:1.建立大鼠视网膜光损伤模型并确立局部玻璃体腔注射重组人促红细胞生成素的量效关系。选用雄性SD大鼠,体重190～210克,随机分为正常组,对照组,以及给药组。动物模型采用自制光损伤箱,白色荧光灯,光照强度平均为2800±150Lux,光照前24小时,进行局部玻璃体腔注射3μl不同浓度单位rhEPO,对照组给予等体积的PBS。注射完毕后大鼠绝对暗适应24小时,光照前30分钟在暗红灯下（光照强度5Lux）采用阿托品、美多丽散瞳,放入光照箱后连续光照5小时,光照结束后置于暗环境饲养（光照强度<150Lux）,大鼠饲养至光照后5天进行全视野ERG检测后处死;2.按照上述方法,在光照后3天取眼球进行电镜观察,在第5天,10天取大鼠眼球,做石蜡切片,进行HE染色,观察形态改变;3.照上述方法,在光照前给药组玻璃体腔给予不同剂量rhEPO可溶性受体,阻断内源性EPO,观察其变化;另外单纯光照组在光照结束后即刻给予玻璃体腔注射最佳剂量的rhEPO,在光照后3天观察ERG变化及形态改变;4.照前述方法,在光照后3天各组取眼球固定,做石蜡切片,进行凋亡原位检测（TUNEL）,同时留取视网膜组织进行凋亡相关蛋白Bcl-xl,Caspase-3的检测;5.在光损伤后0,6,12,24,48,72小时,7d,14天取单纯光照组视网膜组织,检测EPO/EPOR蛋白以及其mRNA表达的变化,并做免疫组化,进行定位观察;6.在光照后0,6小时取各组大鼠视网膜组织,进行相关信号转导蛋白Akt,ERK1,2,STAT5表达的检测,探讨其可能的机制。结果:1.采用自制的光损伤箱,成功建立大鼠视网膜光损伤模型,同时通过对光照后ERG的检测及形态观察,发现玻璃体腔注射5u/3μl rhEPO的浓度,其b波振幅较高。2.在对光损伤后5天,10天HE染色形态观察,rhEPO给药组外核层保存较完整,电镜下观察色素上皮细胞及光感受器外段、内段保存完整,排列规则,外核层凋亡细胞较少,而对照组色素上皮细胞形态不完整,细胞器外流,感受器内外段排列紊乱,断裂,甚至消失,外核层有较多细胞核固缩,间隙增宽;单纯rhEPO给药组电镜下未见明显异常,ERG-b波无明显改变。3.光照后即刻给予rhEPO的其b波振幅较对照组高,与光照前给药组振幅比较差异无统计意义。4.光照前给予EPO可溶性受体20ng,可以使大鼠视网膜光损伤后ERG-b波较对照组低,且形态上外核层厚度减低更多。5. TUNEL检测发现对照组外核层有较多阳性染色细胞核,而给rhEPO组有较少的阳性着染细胞核,EPO给药组Bcl-xl表达增高,Caspase-3表达降低。6.光照后48小时,EPO/EPOR蛋白表达达到高峰,此后下降,EPOR表达相对维持较高水平;EPO/EPOR mRNA表达增高,此后下降,但仍维持相对高的水平。EPOR的表达主要定位于光感受器内外段,外核层,内核层,节细胞层。7.与对照相比,光照后0,6小时,EPO给药组信号转导蛋白Akt, p-Akt, STAT5, p-STAT5的表达无明显变化,而p-ERK1,2表达较对照组减少。结论:1.光照前24h大鼠局部玻璃体腔给予rhEPO 5U, 3μl,可使大鼠视网膜光损伤在形态功能上得到较好的保护作用,剂量效应曲线呈现钟形;光照前给予EPO可溶性受体可使光损伤程度加重;光照5小时后给予rhEPO也有较好的保护作用。2. RhEPO可以明显减少光损伤后凋亡细胞数量,可能通过增加Bcl-xl表达,降低Caspase-3的表达而起到抗凋亡的作用。3.光损伤后,视网膜组织EPO/EPOR蛋白及其mRNA表达增加,提示内源性EPO/EPOR参与视网膜光损伤的内在修复机制。4.在此模型中EPO/EPOR可能通过ERK1,2信号转导途径发挥保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 大鼠视网膜光损伤模型的建立及rhEPO玻璃体腔注射 剂量效应关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 大鼠视网膜光损伤后 EPO/EPOR 表达的变化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 rhEPO 对大鼠视网膜光损伤凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 rhEPO 对大鼠视网膜光损伤防护的信号转导途径
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述 促红细胞生成素对视网膜视神经保护机制研究
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文目录