四种作用于钠通道的蜘蛛毒素的结构与功能研究

论文摘要

1.敬钊缨毛蛛是2001年在我国海南省乐东县发现的捕鸟蛛科新种,结合阳离子交换和反相高效液相色谱技术,我们从粗毒中分离到两种新的多肽。对其测序并分别命名为敬钊缨毛蛛毒素-Ⅱ（JZTX-Ⅱ）和敬钊缨毛蛛毒素-Ⅳ（JZTX-Ⅳ）。分别描述如下:（a）JZTX-Ⅱ由32个氨基酸残基组成,选择性作用于大鼠心肌细胞,延缓其河豚毒素不敏感（TTX-R）钠通道的失活,IC50为0.26±0.09μM。虽然对大鼠DRG神经元上TTX-R型钠通道没有影响,但对其河豚毒素敏感（TTX-S）型钠通道有延缓失活的活性并伴有微弱的抑制峰电流活性,其IC50为0.83±0.15μM。JZTX-Ⅱ还有延缓昆虫神经元TTX-S钠通道失活的活性,其IC50=1.9±0.07μM。对于大鼠海马神经元TTX-S钠通道,JZTX-Ⅱ没有表现有意义的影响。除了与JZTX-Ⅰ有56%的序列一致性外,JZTX-Ⅱ与所有已知的多肽毒素序列同源性都低,预示着JZTX-Ⅱ是一种新型、高选择性蜘蛛多肽毒素。（b）JZTX-Ⅳ由34个氨基酸残基组成,其C末端被酰胺化,是一个比较少见的酸性多肽。电生理活性实验表明JZTX-Ⅳ能抑制大鼠背根神经节（DRG）神经元TTX-S钠通道的失活,伴有弱的抑制峰电流的活性,其IC50=1.77±0.29μM,JZTX-Ⅳ还使稳态激活曲线往去极化方向漂移,与经典的位点4毒素相反。虽然JZTX-Ⅳ对大鼠DRG神经元上的TTX-R钠通道不敏感,但有明显抑制心肌细胞TTX-R钠通道的作用,其IC50=0.90±0.17μM,而且使稳态失活曲线往超极化方向漂移,不同于经典的位点3毒素。研究表明JZTX-Ⅳ对海马神经元钠通道没有表现活性。2.HWTX-Ⅰ是虎纹粗毒中含量最高的毒素,一种突触前N-型钙离子通道抑制剂。实验证明HWTX-Ⅰ对大鼠DRG神经元N-型钙通道和TTX-S钠通道具有抑制作用,半有效浓度分别为55nM和100nM。研究结果表明HWTX-Ⅰ对钙通道的选择性高于MVIIA,与GVIA有相同的专一性。同时,HWTX-Ⅰ是第一个在虎纹捕鸟蛛粗毒中被发现的类似于μ0-conotoxins MrVIA和MrVIB的跨通道活性多肽。我们从头化学合成了HWTX-Ⅰ,复性后的HWTX-Ⅰ通过质谱、反相色谱和电生理活性实验鉴定表明合成HWTX-Ⅰ具有与天然HWTX-Ⅰ完全相同的性质和功能。结果表明合成的HWTX-Ⅰ能完全抑制蜚蠊背侧不成对中间（DUM）神经元和大鼠海马神经元钠电流,半有效浓度分别为4.58±0.58nM和66.1±0.52nM。进一步研究表明高于IC50的浓度下,HWTX-Ⅰ对大鼠DRG、海马、蜚蠊DUM神经元的稳态激活和稳态失活曲线均没有影响。3.海南捕鸟蛛毒液中分离到海南捕鸟蛛毒素-Ⅶ（HNTX-Ⅶ）组成,HNTX-Ⅶ由33个氨基酸残基组成。电生理学实验结果显示HNTX-Ⅶ能抑制大鼠DRG神经元的TTX-R和TTX-S钠通道,也抑制大鼠海马神经元的TTX-S钠通道和蜚蠊DUM神经元的TTX-S钠通道,其IC50分别为0.676±0.049μM、0.169±0.046μM、1.10±0.09μM、15.1±2.7nM。HNTX-Ⅶ对大鼠TTX-S钠通道和TTX-R钠通道的激活曲线和失活曲线没有明显影响,但可使大鼠海马神经元TTX-S钠通道激活曲线往去极化方向漂移10mV,失活曲线往超极化方向漂移13.4mV。HNTX-Ⅶ对不同钠通道亚型动力学有不同影响,也许是一个很好的研究钠通道动力学的工具分子。研究同时表明HNTX-Ⅶ是一种强的昆虫钾通道抑制剂,其IC50为13.7±1.2nM。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 作用于电压门控钠通道的蜘蛛毒素研究进展
• 1.1 电压门控钠通道
• 1.2 蜘蛛电压门控钠通道毒素
• 1.3 电压钳和膜片钳技术在钠通道及其毒素研究中的应用
• 1.4 开展本课题研究的背景和意义
• 第二章 敬钊缨毛蛛毒素-Ⅱ和敬钊缨毛蛛毒素-Ⅳ的结构与功能研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ双通道功能活性研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 海南捕鸟蛛毒素-Ⅶ的分离纯化及活性鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 主要研究结论与进一步研究设想
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 论文发表情况
• 致谢