鲫鱼PKR-like（PKZ）Zα结构域与d（GC）、d（TA）重组质粒的亲和性

论文摘要

Zα是能够识别并特异性结合左旋DNA（Z-DNA）的蛋白结构域。鲫鱼PKR-like（PKZ）是首次报道的具有Zα结构域的鱼类蛋白激酶。为深入了解鲫鱼PKR-like（PKZ）Zα的功能,本研究构建替换型PZα1Zα1的cDNA,并运用PCR定点突变方法构建点突变型(PZαK34A,PZαS35A, PZαR39APZαP57A)的cDNA,然后与表达载体连接,转化表达菌BL21（DE3）pLysS并诱导表达。同时,诱导表达野生型PZα1Zα2。镍柱亲和层析纯化获得突变型融合多肽。另一方面,以pMD18-T质粒为母本质粒,将含有（GC）6、d（GC）13、d（TA）13片段的特殊序列插入到pMD18-T质粒中。甲基化抑制实验证实重组质粒中的插入序列d（GC）6、d（GC）13为“潜在”的Z-DNA。另外,还构建了发夹结构的核酸（d（GC）3T4d（GC）3、d（GC）6T4d（GC）6）和寡聚核苷酸(d（GC）6、d（GC）13)。凝胶阻滞试验分析3种多肽,即野生型PZα1Zα2、替换型PZα1Zα1和4个点突变型(PZαK34A, PZαS35A, PZαR39APZαP57A),分别与重组质粒的亲和性。结果显示:野生型PZα（Zα1Zα2）和替换型P（Zα1）2（Zα1Zα1）能够对3种重组质粒的迁移产生明显的阻滞效应,并且随着多肽浓度的增大,阻滞效应越明显。与野生型PZα（Zα1Zα2）相比,替换型P（Zα1）2（Zα1Zα1）结合重组质粒的能力更强。4种突变体都不能与3种重组质粒结合,暗示鲫鱼PKR-like Zα结构域这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键。凝胶阻滞实验还分析了野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1分别与发夹结构的核酸、寡聚核苷酸的亲和性,结果显示:野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1能够与其发生微弱的结合,但其结合能力差异不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 eIF2α激酶家族
• 1.1.1 eIF2α激酶结构特征
• 1.1.2 eIF2α激酶作用机制
• 1.2 鱼类eIF2α激酶与PKZ
• 1.3 Zα研究进展
• 1.3.1 Zα的功能
• 1.3.2 Zα结构特征
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂、试剂盒
• 2.3 质粒和菌株
• 2.4 相关软件
• Zα1Zα1cDNA的构建'>2.5 替换型P_Zα1Zα1cDNA的构建
• 2.5.1 目的基因片段的克隆
• 2.5.2 目的基因片段的连接与鉴定
• Zα定点突变'>2.6 P_Zα定点突变
• 2.6.1 引物设计
• 2.6.2 质粒模板处理
• 2.6.3 PCR扩增突变产物
• 2.6.4 测序鉴定
• 2.7 原核表达
• 2.8 表达产物的纯化(Pz0
• Zα蛋白质浓度的测定'>2.9 P_Zα蛋白质浓度的测定
• 2.9.1 标准曲线的绘制
• 2.9.2 样品的测定
• 6、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃重组质粒的构建'>2.10 d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃重组质粒的构建
• 2.11 发夹结构核酸与寡聚核酸的构建
• 2.12 甲基化抑制试验
• 6、d（GC）₁₃片段DNA的制备'>2.12.1 含d（GC）₆、d（GC）₁₃片段DNA的制备
• 2.12.2 甲基化抑制试验
• 2.13 凝胶阻滞实验
• Zα与重组质粒d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合'>2.13.1 P_Zα与重组质粒d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合
• Zα与重组质粒d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合'>2.13.2 不同浓度P_Zα与重组质粒d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合
• Zα与发夹结构和寡聚核酸的结合'>2.13.3 P_Zα与发夹结构和寡聚核酸的结合
• 第三章 结果与分析
• Zα1Zα1 cDNA的构建'>3.1 P_Zα1Zα1cDNA的构建
• 3.2 PCR法定点突变
• 3.3 原核表达及纯化
• Zα cDNA的原核表达'>3.3.1 P_ZαcDNA的原核表达
• Zα 的纯化'>3.3.2 P_Zα的纯化
• Zα 浓度的测定'>3.4 P_Zα浓度的测定
• 6、d（GC）₁₃、d（TA）₁₃重组质粒的构建'>3.5 d（GC）₆、d（GC）₁₃、d（TA）₁₃重组质粒的构建
• 3.6 甲基化抑制试验
• 6、d（GC）₁₃片段DNA的克隆'>3.6.1 含d（GC）₆、d（GC）₁₃片段DNA的克隆
• 3.6.2 甲基化抑制实验
• Zα与核酸分子的结合'>3.7 P_Zα与核酸分子的结合
• Zα与重组质粒d（GC）)6、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合'>3.7.1 P_Zα与重组质粒d（GC）)6、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃的结合
• Zα与d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃重组质粒结合'>3.7.2 不同浓度P_Zα与d（GC）₆、d（GC）₁₃和d（TA）₁₃重组质粒结合
• Zα与发夹结构核酸和寡聚核酸的结合'>3.7.3 P_Zα与发夹结构核酸和寡聚核酸的结合
• 第四章 讨论
• 4.1 d（GC）n等核酸分子可以形成Z-DNA
• PKR-like与d（GC）n等核酸分子的结合'>4.2 Zα_PKR-like与d（GC）n等核酸分子的结合
• 4.3 Zα与核酸的结合的分子机理
• 4.3.1 Zα与核酸结合模型
• 4.3.2 Zα与核酸相互作用的保守位点
• 第五章 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录1:缩略语