氯菊酯对致倦库蚊生物活性及抗药性相关基因表达和克隆

论文摘要

媒介昆虫给人类的健康造成严重危害,据统计,1/2的传染病都由媒介昆虫传播。化学防治一直是治理媒介昆虫的主要方法,但是由于多年来杀虫剂大量和连续使用导致媒介昆虫抗药性发生和发展。蚊虫作为一种医学卫生害虫,传播着多种疾病,一直给人们的健康造成严重危害。由于蚊虫抗药性的产生,给防治蚊传疾病带来重大困难。因此,研究抗药性机理并进行适宜抗性治理成为当务之急。本文以室内饲养的致倦库蚊Culex quinquefasciatus敏感品系（S-Lab）和氯菊酯的抗性品系（MamCq,HamCq,BamCq,MamCqⅡ和HamCqⅨ）为主要试材,通过生物测定,基因克隆,以及实时荧光定量PCR检测等方法,研究蚊虫抗药性产生的机理及探讨抗性治理方法。氯菊酯对实验室内不同品系S-Lab,MamCq,HamCq,BamCq,MamCqⅡ和HamCqⅨ的不同虫龄不同虫态试虫进行毒力测定。结果表明,HamCq,HamCqⅨ,MamCq,MamCqⅡ和BamCq的LC50（μg/mL）与S-lab的LC50（μg/mL）进行比较后所得抗性比在1龄幼虫时,分别为:1,26,4,15和10倍;2龄幼虫时,分别为:3,185,7,9和45倍;3龄幼虫时,分别为:3,225,3,8和59倍;四龄幼虫时,分别为:10,748,2,9和77倍。成虫期,不同品系雌虫间的LD50（μg/individua）抗性比,分别为:3,64,0.3,0.7和1.3倍,雄虫间的抗性比,分别为:2,67,0.5,0.67和3倍。其中,雌虫大约是雄虫的10倍。应用固醇携带蛋白-2（AeSCP-2）生物抑制剂SCPIs（SCPI-1,SCPI-2）,对实验室内致倦库蚊不同品系（S-Lab,BamCq,MamCqⅡ和HamCqⅨ）进行毒力测定,结果表明,两种生物抑制剂SCPIs对致倦库蚊不同品系低龄幼虫都有一定的毒力,SCPI-1对S-Lab,HamCqⅨ,MamCqⅡ和BamCq的LC50分别为:1.710,2.601,1.323和2.738μmol/L;SCPI-2的LC50分别为:0.306,0.142,0.353和1.276μmol/L。当SCPIs和氯菊酯共同作用时,对氯菊酯的毒力有一定增强作用,SCPI-1和SCPI-2对敏感品系S-lab分别有5.3,3.2倍的增效,对抗性品系MamCqⅡ,HamCqⅨ和BamCq分别有4,16.8,4倍和2,4.8,1.6倍的增效。从致倦库蚊对氯菊酯抗性品系（HamCq和HamCqⅨ）4龄幼虫中克隆到2个细胞色素P450基因编号为—P450-18和P450-26片断,大小分别为576bp和664bp。与GeneBank上已知序列进行分析,推测这两个基因属于P450CYP9基因家族。用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）分别检测这两个基因在敏感与抗性品系中的表达量差异及在不同品系的各虫期表达量差异,结果表明,这两个基因在致倦库蚊对氯菊酯抗性品系中各虫期表达量均高于敏感品系,P450-18基因在HamCqⅨ和HamCq品系幼虫期和成虫期相对于S-Lab品系的表达量分别为:110,4倍和6,3倍;P450-26基因表达量分为:194,48倍和1.64,1.54倍。各虫期中,以四龄幼虫表达量最高,P450-18,P450-26基因分别在S-Lab,HamCq和HamCqⅨ品系幼虫期的表达量分别为成虫期的20,25,352倍和1.34,39,169倍。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 媒介昆虫抗药性的产生
• 2 蚊虫抗药性的产生
• 3 蚊虫抗药性机理的研究
• 4 P450基因家族与抗药性相关的研究
• 第一章 氯菊酯的生物测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药剂
• 1.1.2 供试虫源
• 1.1.3 饲养条件
• 1.2 方法
• 1.2.1 氯菊酯对致倦库蚊不同品系幼虫的毒力测定
• 1.2.2 氯菊酯对致倦库蚊不同品系成虫的毒力测定
• 1.2.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 氯菊酯对不同品系幼虫的毒力
• 2.2 氯菊酯对不同品系成虫的毒力
• 3 讨论
• 第二章 生物抑制剂对氯菊酯的毒力影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药剂和生物抑制剂
• 1.1.2 供试虫源
• 1.1.3 饲养条件
• 1.2 方法
• 1.2.1 生物抑制剂对不同品系低龄幼虫的活性测定
• 1.2.2 生物抑制剂对致倦库蚊的最大无活性剂量的测定
• 1.2.3 氯菊酯与生物抑制剂对不同品系低龄幼虫的联合毒力测定
• 1.2.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 生物抑制剂对不同品系低龄幼虫的活性
• 2.2 生物抑制剂对致倦库蚊的最大无活性剂量
• 2.3 氯菊酯与生物抑制剂对不同品系低龄幼虫的联合毒力
• 3 讨论
• 第三章 P450基因家族两个基因片段的表达差异及克隆、测序
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试虫源
• 1.1.2 饲养条件
• 1.1.3 化学试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 P450基因片段的克隆—P450-18和P450-26
• 1.2.2 基因测序
• 1.2.3 不同品系总RNA的提取
• 1.2.4 总RNA中除去DNA
• 1.2.5 第一链cDNA的制备
• 1.2.6 实时荧光定量PCR检验
• 2 结果与分析
• 2.1 P450-18与P450-26基因片段的克隆、测序
• 2.2 实时荧光定量PCR检测及分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢