论文摘要
本研究成功建立了沙门氏菌快速检测体系，包括斑点免疫金渗滤法、免疫金试纸条法、PCR快速检测法和荧光定量PCR检测法，对一系列反应条件进行了优化，建立了相应的检测试剂盒，并已应用于日常检测和厦门市畜禽产品中沙门氏菌污染状况的调查，检测时间从常规法的4-5天缩短为2天，大大加快了沙门氏菌的检测速度。同时对分离的沙门氏菌进行了药敏试验和耐药程度分析，以了解沙门氏菌当前的耐药情况，建立了多重PCR方法同时检测四环素二种耐药基因，从分子水平了解沙门氏菌的耐药情况。现将所做工作摘要如下：1、沙门氏菌快速检测试纸条的研制与应用。应用提纯的兔抗沙门氏菌抗体包被硝酸纤维素膜检测线，羊抗兔IgG包被对照线，然后用胶体金标记纯化的兔抗沙门氏菌抗体建立了检测沙门氏菌的快速检测试纸条。该法通过胶体金标记兔抗沙门氏菌抗体直接显色，阳性者检测线出现红色线，整个试验过程仅需10～15 min即可判断结果。与大肠杆菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌等常见肠道菌不发生交叉反应。与沙门氏菌的最低检测量为2.3×105 cfu／ml，且检测时间从国标法的4～5天缩短到2天，并与国标法的符合率达到100％。将试纸条4℃或37℃存放9个月，检测结果无差异。整个操作过程不到1分钟，比斑点免疫金渗滤法更为简便，实验结果更加直观，肉眼即可判断，且可以保存。非常适合广大养殖户、基层检疫部门和突发中毒事件时使用。2、斑点免疫金渗滤法检测沙门氏菌的研制与应用。首先将制备的兔抗沙门氏菌抗体用与之出现交叉反应的大肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和阴沟杆菌等进行吸附，然后离心，取上清液用Protein A Sepharose TMCL-4B柱进行纯化，测的蛋白含量为3.84mg／mL。然后用胶体金标记纯化的兔抗沙门氏菌抗体，SPA（金黄色葡萄球菌A蛋白）包被硝酸纤维素膜作对照点，用沙门氏菌标准菌株进行反应条件的优化，建立直接检测沙门氏菌的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）检测试纸盒。整个试验过程仅需10～15分钟即可判断结果，操作简单，无需特殊仪器设备，阳性者出现红色斑点，结果易于判断，与大肠杆菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌等不发生交叉反应。与沙门氏菌的最低检测量为4.5×106cfu／mL，同时将该法与国标法检测效果比较，检测时间从4～5天缩短到2天，符合率达100％。将胶体金标记的兔抗沙门氏菌抗体冻干粉4℃存放12个月，检测结果无差异。该方法非常适合基层普查使用。3、沙门氏菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用。根据沙门氏菌属高度保守的菌毛fimY基因序列设计了一对引物，建立了用于检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的A-F群标准菌株和临床分离的60株沙门氏菌分离株和11种非沙门氏菌菌株进行PCR扩增，扩增产物用1.8％琼脂糖电泳进行观察，结果所有沙门氏菌均扩增出526bp的特异性条带，而非沙门氏菌菌株未扩增出任何条带。通过电泳判定结果，该法可检出扩增体系中93cfu的沙门氏菌，还可检出含3cfu沙门氏菌的样品用BP预增菌或用MM增菌后的菌液。而且该试剂稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。说明该方法敏感性高、特异性强、稳定性好。采用直接菌体加入法、热裂解、反复冻融、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板，结果CTAB法效果最好，但操作烦琐，而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒同样的效果，且操作简便快速、经济、效果好，值得推广应用。本研究为沙门氏菌属的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法。也可以作为斑点免疫金渗滤法和免疫金试纸条法的确认方法。4、沙门氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制与应用。根据沙门氏菌属高度保守的菌毛fimY基因序列设计了一对引物和TaqMan探针，建立了用于检测沙门氏菌的实时荧光定量PCR方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒，其检测灵敏度达到4.5cfu，比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，冷冻至少可以保存9个月，而与其它非沙门氏菌不存在交叉反应。特别适合有条件的检疫部门开展大量样品的检测。5、沙门氏菌快速检测系列方法的应用。将建立的四种检测方法用于厦门市畜禽产品中沙门氏菌污染情况的调查。通过近三年调查，厦门市畜禽产品等沙门氏菌污染率为1.72％（81／4705），其中超市销售的畜禽产品总体状况良好，污染率为0.43％（9／2350）。厦门地区生猪养殖场部分猪场（26.7％）、农贸市场销售的猪产品（9.33％）和现场屠宰的禽类（2.67％）以及原高崎肉联厂屠宰生猪（10％）沙门氏菌污染较为严重，应加强管理，特别应加强消毒清浩工作。6、多重PCR技术同时检测沙门氏菌四环素二种耐药基因方法的建立和应用。根据质粒pRT11和质粒pBR322中相应的四环素耐药基因—TetB和TetC的基因序列设计了两对特异性引物，建立了同时检测四环素耐药基因TetB和TetC的多重PCR方法。通过对35株沙门氏菌临床分离株的四环素耐药性的检测，结果表明所有沙门氏菌分离株均含TetC基因，与药敏试验结果阳性符合率65.7％（23／35），其中8株同时含有TetB基因，与药敏试验结果阳性符合率100％，选取其中部分菌株扩增出的TetB和TetC基因片段进行测序分析，结果表明，所测5株菌的TetB基因扩增产物与质粒pRT11中的相应序列有很高的同源性，均为99.7％，而相互之间的同源性为100％；所测14株菌的TetC基因扩增产物与质粒pBR322中的相应序列有很高的同源性，均为100％。证实沙门氏菌耐药基因普遍存在，且同时含有TetB和TetC基因的菌株表现耐药。建立多重PCR技术同时检测四环素耐药基因，简便快速、省时省财，特别适合于大量样本的检测，这对开展沙门氏菌四环素多种耐药基因的分子流行病学监测提供了有效的检测途径。将建立的多重PCR方法用于检测临床分离的奇异变形杆菌、弗氏枸橼酸杆菌和绿脓杆菌，发现四环素耐药基因TetC也普遍存在上述细菌中，同时检出TetB和TetC的概率也很高。说明所建立的方法可作为四环素耐药基因检测的通用方法。7、对厦门市畜禽产品中分离的沙门氏菌分离株进行了24种药物敏感试验和五种抗生素的药物耐受研究。采用24种常用药敏试纸开展59株沙门氏菌分离株的耐药情况分析，为养殖场合理用药提供参考。实验结果发现当前沙门氏菌耐药性越来越强，其中普遍对四环素、强力霉素、氨苄青霉素、青霉素、红霉素、利福平、麦迪霉素、新生霉素、痢特灵和氯霉素等耐药，有些菌株甚至对高效抗生素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋Ⅴ、头孢拉定和环丙沙星出现耐药。其中能耐受3～10种抗生素的菌株数为2、5、6、13、11、7、3和2，所占百分比为3.4、8.5、10.2、22.0、18.6、11.9、5.1和3.4，能耐受12、14和15种抗生素的菌株为1、5和4株，占1.7％、8.5％和6.8％。其中从厦门地区生猪饲养户分离的4株菌有3株能耐受15种抗生素，1株耐7种。同时还重点开展了51株分离株对链霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素和磺胺等五种抗生素的药物耐受研究，结果四环素耐药超过16ug／ml的菌株达35株（占68.6％，35／51），链霉素耐药超过16ug／ml的菌株达23株（45.1％，23／51）、氨苄青霉素超过16ug／ml的菌株达14株（占27.5％，14／51）、氯霉素超过16ug／ml的菌株达31株（占60.8％，31／51）和磺胺超过1600ug／ml的菌株达51株（占100％，51／51）。这提示细菌的耐药程度越来越严重，再次提醒人们合理使用药物。