SOX4参与了DNA损伤反应中p53的激活

论文摘要

DNA损伤反应（DDR）是人体抵御肿瘤恶性增殖的重要防御机制,DDR组分的突变与肿瘤发生密切相关。抑癌蛋白p53,DDR中最重要的中枢信号分子,在人类肿瘤中有大约一半为缺失或突变。SOX4在许多肿瘤细胞中高表达,但是它在肿瘤发生发展中发挥的作用机制至今很不明确。本项研究中,我们首先在肿瘤细胞中检测了DNA损伤反应中SOX4的表达情况。结果表明DNA损伤信号能诱导SOX4的表达,并且这种SOX4的诱导并不依赖于p53。值得注意的是,我们通过Western blot、荧光素酶报告系统和染色质免疫沉淀证明敲低SOX4的表达影响DNA损伤反应中p53的激活。进一步,我们通过体内体外的GST pull-down和免疫共沉淀实验证明SOX4能与p53发生相互作用,Mapping实验还表明SOX4和p53各有两段结构域与对方结合。通过荧光素酶报告系统我们采用不同的p53报告基因证明SOX4能特异地增强p53的转录活性,并且SOX4这种对p53活性的上调依赖于二者的相互作用。进一步我们发现SOX4能促进p53蛋白稳定性,延长p53蛋白质的半衰期。SOX4通过减弱p53和Mdm2的相互作用而抑制Mdm2介导的p53泛素化降解和出核,从而稳定p53蛋白质。SOX4对p53激活作用具有重要生理意义,因为SOX4促进p53依赖的细胞周期G1期阻滞,细胞凋亡。克隆形成实验和裸鼠成瘤实验进一步表明,SOX4具有以p53依赖的方式抑制肿瘤增殖的效应。SOX4在肿瘤发生发展过程中发挥作用的分子机制至今不明确,我们的研究证明SOX4能结合并调控重要抑癌蛋白p53,这不仅为今后更深入地研究SOX4在肿瘤发生中的作用提供了可靠的线索,同时,我们鉴定的SOX4作为DNA损伤反应中一个新的p53调节蛋白也丰富了人们对复杂的p53调控网络的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1. 材料及来源
• 1.1. 菌株和质粒
• 1.2. 主要试剂和抗体
• 2. 实验方法
• 2.1. 质粒构建
• 2.2. 细胞培养和转染
• 2.3. 荧光素酶活性测试实验
• 2.4. GST沉淀实验（GST pull-down）
• 2.5. 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）
• 2.6. 免疫荧光染色实验
• 2.7. RNA干涉实验
• 2.8. 流式细胞术
• 2.9. 染色质免疫沉淀（ChIP）
• 2.10. 结晶紫实验
• 2.11. 软琼脂实验
• 2.12. 裸鼠成瘤实验
• 结果
• 1. SOX4 能被DNA损伤信号诱导并参与了p53 的激活
• 1.1. D NA损伤信号诱导SOX4 蛋白表达上调
• 1.2. SOX4 在DNA损伤反应中的上调不依赖于p53
• 1.3. SOX4 参与了DNA损伤反应中p53 的激活
• 2. SOX4 与p53 发生相互作用
• 2.1. SOX4 与p53 体外相互作用
• 2.2. 外源SOX4 与p53 体内相互作用
• 2.3. 内源SOX4 与p53 的相互作用
• 2.4. SOX4 与p53 共定位于细胞核中
• 3. SOX4 增加p53 的转录活性
• 3.1. SOX4 增加外源p53 的转录活性
• 3.2. SOX4 增加内源p53 转录活性
• 3.3. SOX2 对p53 活性无影响
• 4. SOX4对p53 的转录激活依赖于二者的相互作用
• 4.1. p53 与SOX4 相互作用区域的确定
• 4.2. SOX4 与p53 相互作用区域的确定
• 4.3. SOX4 和p53 各有两个结构域与对方结合
• 4.4. SOX4 激活p53 依赖于二者的相互作用
• 5. SOX4 增加p53 蛋白质稳定性
• 5.1. SOX4 上调外源p53 蛋白水平
• 5.2. SOX4 上调内源p53 蛋白水平
• 5.3. SOX4 对p53 的mRNA水平没有影响
• 5.4. SOX4 延长p53 蛋白半衰期
• 6. SOX4 抑制Mdm2 介导的p53 泛素化降解和出核
• 6.1. 敲低SOX4 表达引起p53 泛素化增加
• 6.2. SOX4 抑制Mdm2 介导的p53 降解
• 6.3. SOX4 抑制Mdm2 介导的p53 泛素化
• 6.4. SOX4 干扰Mdm2 与p53 的相互作用
• 6.5. SOX4 阻止Mdm2 介导的p53 核外移
• 7. SOX4 调控p53 依赖的细胞周期阻滞、凋亡和肿瘤生长
• 7.1. SOX4 促进p53 依赖的细胞周期G1 期阻滞
• 7.2. SOX4 参与了p53 依赖的凋亡调控
• 7.3. SOX4 以p53 依赖的方式抑制肿瘤细胞克隆形成能力
• 7.4. SOX4 抑制肿瘤细胞成瘤性
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢