杨扇舟蛾等几种重要林业昆虫细胞系的建立及颗粒体病毒体外增殖研究

论文摘要

迄今为止,国内外已经建立了来源于150多种昆虫的800株以上的昆虫细胞系,其中260株以上为鳞翅目昆虫的细胞系,但相对于已知的几十万种昆虫来说,这些细胞系还远远不够。在某些研究方面,仍然需要特定昆虫种类来源或者特定细胞类型的细胞系。在培养细胞中,各种病毒也具有不同的受纳细胞系统。一般说来,核型多角体病毒比较容易在昆虫细胞系中复制,但在颗粒体病毒中至今尚未建立一个比较满意的颗粒体病毒——细胞离体系统,因此,有必要建立更多新的昆虫细胞系,为害虫病毒的规模化扩增打下基础。本研究选取9种重要的林业害虫进行细胞系建立和杆状病毒增殖,并尝试对已建立的细胞系进行无血清培养,试图为林业昆虫病毒杀虫剂的规模化生产以及杆状病毒表达载体系统的构建和研究,提供有效的技术手段。本研究选取的9种重要的林业害虫为:杨扇舟蛾（Clostera anachoreta）、美国白蛾（Hyphantria cunea）、春尺蠖（Apocheima cinerarius）、枣尺蠖（Sucra jujuba）、茶尺蠖（Ecotropis Obliqua）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、鞭角华扁叶蜂（Chinolyda flagellicornis）、月季叶蜂（Arge pagana）。对这些害虫先进行解剖,取胚胎、卵巢、精巢、血细胞和脂肪体,然后建立原代培养,选用TNM-FH, IPL-41, Excell-405, Excell-420, TC-100昆虫培养液进行培养。结果表明,产下约4天的鳞翅目昆虫受精卵比较容易游离出细胞并建立成细胞系。经过培养,成功建立了两株来源于杨扇舟蛾胚胎的细胞系,分别命名为CAF-ClanⅠ和CAF-ClanⅡ,现已传代分别传到第78代和57代,其合适的培养液为TNM-FH+10%灭活的胎牛血清,最适宜的pH值是6.4。两株细胞系的特点为:CAF-ClanⅠ细胞大部分悬浮,有少量贴壁,细胞的形状有:圆形、梭形和似巨噬形3种;CAF-ClanⅡ的细胞大部分贴壁,主要由圆形和梭形细胞组成。在27℃培养条件下,CAF-Clan I第22代细胞和CAF-Clan II第24细胞的群体倍增时间分别为68.5h和38.2h;两株细胞系第15代的染色体数目范围大部分在62100之间,也有少数细胞超过260 （n=30）。随后,运用DAF-PCR方法鉴定了这两种细胞系表明其来源于杨扇舟蛾。并测定了两株细胞系对几种杆状病毒的敏感性。结果显示:CAF-ClanⅡ细胞系对杨扇舟蛾颗粒体病毒（ClanGV）、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）、茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）三种病毒敏感,所产生AcMNPV和EoNPV的包涵体产量分别为129±4OBs/细胞和124±15 OBs/细胞。出芽型ClanGV（ClanBV）接种CAF-Clan II的TCID50为6.5×105 TCID50/mL。与CAF-ClanⅡ相比,CAF-ClanⅠ细胞系对ClanGV和AcMNPV敏感性稍低,对EoNPV、美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）和春尺蠖核型多角体病毒（AciNPV）不敏感。两株细胞系长期冻存在-80℃和液氮中并多次成功复苏。CAF-Clan I的单细胞克隆正在进行放大培养。研究中,还进行了所培养的细胞系接种、复制杨扇舟蛾颗粒体病毒的试验。结果表明,两种细胞系接种杨扇舟蛾颗粒体病毒后,在15℃和27℃的温度条件下,受侵染的细胞系细胞切片在电子显微镜下观察,可见病毒发生基质、核衣壳、病毒粒子和包涵体等不同阶段的形态结构发生,但未观察到包涵体中的单粒包埋病毒粒子,包涵体大小与接种的杨扇舟蛾颗粒体病毒大小一致,表明ClanGV可以侵染CAF-ClanI和CAF-ClanII细胞,但复制是否完整需要进一步试验验证。针对两株细胞系在几种培养液中的生长状况,尝试配制了一种无血清培养基。目前,CAF-Clan I和CAF-Clan II已在这种培养基中生长了5代。这种改进的无血清培养基的成本是商品化培养基的31.8～47%。论文还对其他8种重要林木害虫的细胞系培养进行了研究。其中,取自美国白蛾胚胎的一瓶原代培养细胞已经成功传了第4代,有望建成1株新的细胞系。春尺蠖和光肩星天牛等其他林业昆虫的原代培养还在进行中。适合美国白蛾和春尺蠖细胞生长的的培养液是IPL-41+10%FBS。本研究建立了2株新的鳞翅目昆虫细胞系,丰富了昆虫细胞系资源;进行了两种细胞系复制杨扇舟蛾颗粒体病毒的试验,表明其对病毒敏感,具有良好的体外复制该颗粒体病毒的前景;再者,本研究中研制的无血清培养液具有良好的应用价值,为进一步研究昆虫病毒、构建杆状病毒表达载体系统以及规模化生产昆虫病毒杀虫剂提供了有效的支撑;还进行了美国白蛾及其他8种重要的林业害虫细胞的原代及传代培养,为它们的成功建系奠定了基础。本研究还发现,在进行昆虫细胞系建立时,选取产下约4天的受精卵,将解剖出的胚胎组织切成微小的组织块可以促使其游离出较多的细胞,便于建立成昆虫细胞系。本结论为今后建立新的昆虫细胞系提供了技术上借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究现状及评述
• 1.2.1 杆状病毒杀虫剂研究进展
• 1.2.2 昆虫细胞培养研究现状
• 1.2.3 昆虫细胞培养液研究进展
• 1.2.4 颗粒体病毒离体复制研究进展
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 关键的科学问题与研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 第二章 杨扇舟蛾胚胎细胞系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 原代培养
• 2.2.2 传代及建立细胞系
• 2.2.3 细胞系的形态特征
• 2.2.4 细胞系的生长曲线
• 2.2.5 染色体分析
• 2.2.6 运用DAF-PCR 鉴定细胞系
• 2.2.7 细胞系对pH 值的选择
• 2.2.8 细胞的冻存和复苏
• 2.2.9 单细胞克隆
• 2.2.10 细胞系对ClanGV 等五种杆状病毒的感染敏感性测定
• 2.3 小结
• 第三章 杨扇舟蛾颗粒体病毒在细胞系细胞中的形态发生
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 供试杨扇舟蛾颗粒体病毒形态
• 3.2.2 杨扇舟蛾颗粒体病毒在细胞内的形态发生
• 3.3 小结
• 第四章 杨扇舟蛾细胞系无血清培养基的研制
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 细胞系对不同培养基的选择
• 4.2.2 无血清培养基的配方
• 4.2.3 细胞对无血清培养基的适应和生长特性
• 4.2.4 配制培养液与购买商品化培养液成本比较
• 4.3 小结
• 第五章 其他几种重要林业害虫细胞的原代、传代培养研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 美国白蛾的原代培养及传代培养
• 5.2.2 春尺蠖的原代培养及传代培养
• 5.2.3 茶尺蠖及枣尺蠖的原代培养
• 5.2.4 鞭角华扁叶蜂及月季叶蜂的原代培养
• 5.2.5 光肩星天牛及桑天牛的原代培养及传代培养
• 5.3 小结
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.2 讨论
• 6.2.1 胚胎时期的选择与细胞能否传代继而建系的关系
• 6.2.2 细胞系形态的变化
• 6.2.3 传代方法
• 6.2.4 两株细胞系对杆状病毒敏感性不同原因的分析
• 6.2.5 胚胎来源的细胞系与颗粒体病毒敏感性的关系
• 6.2.6 颗粒体病毒体外复制的稳定性
• 6.2.7 细胞低温培养与颗粒体离体复制的关系
• 6.2.8 关于研制的无血清培养液
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录A 试剂配制及供试培养液
• 附录B 实验仪器及耗材型号、厂家
• 附录C 专有名词表
• 在读期间的学术研究
• 致谢