血管内、外膜分别损伤诱发的动脉粥样硬化形成及MAPK/NF-κB信号通路的比较研究

论文摘要

血管内皮损伤被一直认为是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病的始动因素,而近年研究发现血管外膜参与了AS的形成,炎症、氧化应激可能是主要机制。无论是从内膜损伤还是从外膜损伤开始诱发的AS形成,炎症、氧化应激、免疫调节的失衡是共同的发病机制。炎症、氧化应激、免疫调节是通过各种信号通路传递信号的,内膜损伤和外膜损伤所引起的信号传递过程可能相似性,也可能有所不同。因此,我们拟通过在同一个体建立外膜损伤和经典的内膜损伤诱导AS形成的动物模型,比较两种病变形成共同和不同的规律、特点,比较“从内而外”和“从外而内”两种信号传递途径的异同,进一步了解外膜在AS发生、发展中的作用。全文由四部分组成。第一部分内外膜损伤致动脉粥样硬化的模型的建立目的:通过在同一个体建立外膜损伤和经典的内膜分别损伤诱导AS形成的动物模型,比较两种病变形成规律和特点的异同。方法:在同一兔的两侧颈动脉,采用胶原酶分别消化颈动脉内皮和外膜的方法建立兔内膜和外膜损伤模型。分别于损伤后1w、2w、4w、8w取材,做石蜡切片和冰冻切片,采用HE、免疫组化、油红O染色方法,观察血管内膜增生情况及其构成成分。结果:血管内、外膜损伤后1周即出现了内膜的增生,随着时间的延长,斑块面积进行性增大。1周时内膜损伤组IMR＜外膜损伤组（0.29±0.02 vs 0.11±0.01,p＜0.05）,而1周后内膜损组内膜增生加速,逐渐与外膜损伤组相近,8w时内膜损伤组IMR＞外膜损伤组（0.63±0.05 vs 0.52±0.03）。油红O染色:可见血管损伤高脂饮食所致的病变中弥漫的橘红色阳性着色。α-actin免疫组化染色显示在血管损伤的早期血管病变内膜中有稀疏的阳性着色,提示病变中部分为平滑肌细胞。而随着病变的进展,无论是内膜损伤组还是外膜损伤组,血管内膜病变中CD68免疫组化染色有较密的阳性着色,提示病变中有大量巨噬细胞聚集。结论:胶原酶消化法分别损伤血管内外膜,可有效破坏血管内外膜的完整性,诱发AS的形成。外膜损伤诱发的内膜增生早于内膜损伤,但AS程度轻于内膜损伤。第二部分经血管外膜给药抑制MAPK及NF-κB信号通路的效果评价目的:以Pluronic-F127（PF127）为载体,制作含有p38、JNK、NF-κB抑制剂的缓释凝胶,经血管外膜局部给药,观察对局部血管p38、JNK、NF-κB表达的抑制作用。方法:制备PF127缓释凝胶,将p38、JNK、NF-κB抑制剂均匀溶解于PF127缓释凝胶,充填于血管周围。于给药后24h、72h、1w、2w、4w取材,用免疫组化和Western blot检测p38、JNK、NF-κB的表达情况。结果:（1）p38抑制组:Western blot检测发现给药即刻、24h、72h p-p38的无明显变化（P＞0.05）,1w开始,p-p38的表达明显下降（P＜0.05）,与免疫组化结果相一致。而p38的表达在给药后的各个时间点均无明显变化。（2）JNK抑制组:给药后1w至4周,血管壁内、中、外膜的p-JNK表达均明显减少,至4w时完全看不到阳性颗粒。（2）NF-κB抑制剂组:免疫组化发现,外膜给药后1w内血管NF-κB p65的表达均无明显变化,而1w后至4w血管完全呈阴性（图2-5）。Western blot结果与免疫组化结果比较一致,蛋白表达量较低,0d～1w无显著差异（p＞0.05）;1w后蛋白表达量明显降低（p＜0.05）结论:经外膜给以PF127缓释凝胶为载体的p38、JNK、NF-κB抑制剂可有效抑制p38、JNK、NF-κB的表达。第三部分MAPK、NF-κB信号通路在内外膜损伤诱导的AS形成中的作用目的:比较MAPK、NF-κB通路在内外膜损伤诱导的AS形成过程中的变化规律;通过外膜给药的方法,特异性的抑制血管MAPK、NF-κB信号通路,明确MAPK—NF-κB信号通路在内外膜损伤致AS形成中的作用。方法:在已建立的内外膜损伤模型的基础上,于模型建立后24h、72h、1w、2w、4w、8w取材,Western blot检测p38、JNK、ERK、NF-κB的表达的变化规律。经血管外膜给予含p38、JNK、NF-κB抑制剂的PF127缓释凝胶,观察2、4w血管内膜增生情况,以及p38、JNK、NF-κB的表达。结果:血管内膜损伤和外膜损伤对MAPK和NF-κB的影响有相似点也不同之处。二者都可以引起p-p38、p-JNK和NF-κB表达的上调,但ERK则内外有别,外膜损伤不能上调ERK的表达,但内膜损伤则以上调ERK1为主。经外膜给含p-p38、p-JNK和NF-κB的缓释凝胶可有效抑制血管p-p38、p-JNK和NF-κB的表达,延缓AS进程。结论:MAPK/NF-κB在内外膜损伤诱导的AS形成过程表达均明显增高,通过抑制MAPK/NF-κB信号通路可减轻损伤诱导的内膜增生。证明MAPK/NF-κBAS发生进展的重要通路。第四部分通心络对内外膜损伤致AS形成的干预作用及机制目的:观察通心络抑制血管内外膜损伤诱导的AS形成的效果,以及对MAPK、NF-κB信号通路的影响。方法:在已建立的内外膜损伤模型的基础上,给予通心络干预8w。行HE、免疫组化和Western blot检查,观察通心络损伤诱导的内膜增生的抑制作用,以及对p38、JNK、ERK、NF-κB的表达影响。结果:通心络可抑制内外膜损伤诱导的AS形成的作用,具有明显的抗动脉粥样硬化作用。通过对MAPK、NF-κB信号通路进行免疫组化和Western blot分析。通心络可以抑制内膜损伤组和外膜损伤组的p-p38、p-JNK的表达,而对于NF-κB,通心络仅能抑制内膜损伤组的表达,而对外膜损伤组则无作用。结论:通心络可以抑制内膜和外膜损伤诱导的动脉粥样化的发生和进展,其机制可能与通心络抑制MAPK、NF-κB信号通路有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 血管内、外膜损伤致动脉粥样硬化形成模型的建立
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 经血管外膜局部给药抑制MAPK及NF-κB信号通路的效果评价
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 MAPK及NF-κB在内外膜损伤诱导的动脉粥样硬化形成中的作用
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 通心络对内、外膜损伤致动脉粥样硬化形成的干预作用及机制研究
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第五部分 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 致谢