多菌灵降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究

论文摘要

从长期受多菌灵污染的土壤和处理多菌灵废水的污泥中分离到3株高效多菌灵降解菌株，分别命名为djl-6、djl-6-2和CBDM-12。根据它们的培养特征、生理生化特征以及16s rDNA序列的同源性分析等，鉴定为红球菌属。研究表明，这3株多菌灵降解菌都是革兰氏阳性菌，有球杆状变化，都能在添加多菌灵的无机盐平板上产生清晰可见的透明圈；其中djl-6在LB上培养时，菌落呈橙色；djl-6-2和CBDM-12菌落呈乳黄色；3株菌的最适生长温度为30℃、pH值为7.0；都能耐受一定浓度的NaCl和抗生素；对葡萄糖和果糖等单糖的利用要好于麦芽糖和淀粉等多糖，对蛋白胨、牛肉膏和酵母等有机氮源的利用明显的优于以硫酸铵等无机氮源。降解菌株均能以多菌灵为唯一碳、唯一氮和唯一碳氮源进行生长。3株菌以多菌灵为唯一氮源时的生长和降解速度均好于以多菌灵为唯一碳和唯一碳氮源时的生长和降解速度。它们均能在2～3天时间内几乎完全降解100mg．L-1的多菌灵，降解效果明显优于国内外已经报道的多菌灵降解菌株；降解菌株在中性稍微偏碱的环境中更有利于其对多菌灵的降解，它们降解多菌灵的最适温度都为30℃，其中菌株djl-6和djl-6-2降解多菌灵有比较宽的温度耐受范围；它们降解多菌灵的最适的Na+浓度范围为20～30g．L-1，通气量对3株菌降解多菌灵的影响不大；添加酵母粉和葡萄糖对多菌灵的降解有一定的促进作用，添加土壤浸液对多菌灵的降解没有影响；Cu2+对3株菌降解多菌灵有一定的抑制作用，其他的金属离子对多菌灵的降解没有太大影响；3株菌都能有效的降解苯菌灵和苯酚，对速灭威和甲霜灵也有一定的降解效果；所有这些特性表明3株菌可作为多菌灵污染生物修复的理想材料。系统发育分析和生理生化特征比较分析结果表明，djl-6和Rhodococcus baikonurensis、Rhodococcus erythropolsis亲缘关系较近，和Rhodococcus globerulus较远；多相分类结果表明，djl-6细胞中主要的脂肪酸组成为：C14∶08.12％、C15∶0 1SO 2OH8.49％、C16∶025.97％、C18∶07.01％、C18∶1 w9c7.32％、C18∶0 TBSA 10Mc19.81％、C19∶04.31％、C20∶0 3.36％；氨基酸为：meso-DAP、Ala、Glu、Gly和Asp；糖为半乳糖，阿拉伯糖和葡萄糖；醌为MK-8（H2）；G+C mol％为59.1；djl-6和R．baikonurensis DSM44587、R．erythropolis DSM43066，R．globerulus DSM43954的DNA-DNA杂交同源性分别为23.8518％、31.8361％和-17.7155％（为0％）。所有这些特性表明djl-6是红球菌属中的一个新种，初步命名为庆笙红球菌Rhodococcus qingshengensis sp．nov．。多菌灵降解酶是一种胞内非诱导组成型的酶。在提取该酶时，可把djl-6在LB培养基中培养到72～84h为宜，然后可采用添加溶菌酶、超声波破碎或French压榨等方法来提取。采用添加溶菌酶方法提取的降解酶酶活较高，而采用超声波和French压榨破碎虽然提取的酶量较大，所得总蛋白浓度也较高，但是酶活损失较大；多菌灵降解酶的最佳反应体系为在PH 7.0的缓冲系统中，控制温度为30℃，在5mL反应体系中添加30μL的粗酶液，反应时间控制在1小时之内，通常为30分钟；多菌灵降解酶在pH 7.0～8.0，温度4～45℃的范围内较稳定；金属离子Zn2+和K+对酶活有抑制作用。添加Tween 20对酶活测定没有影响，而添加Triton X-100和SDS，当浓度超过100mg．L-1时就能对降解酶的活性产生一定地抑制作用；粗酶液的硫酸铵分级沉淀效果表明，当在上清液中添加硫酸铵浓度达到50％后，上清液中的酶活骤然降低。沉淀蛋白在硫酸铵的添加浓度达到40％以后，酶活就骤然上升，在50％以后达到最大。所以在用硫酸铵沉淀粗酶时可选择50％的硫酸铵沉淀浓度对降解酶进行粗分；同时降解酶能够在添加多菌灵的非变性胶上产生清楚可见的透明带。与此透明带对应的条带酯酶染色表明，该酶同时也是一种酯酶。把分离胶中的透明带切胶回收，可回收到一条分子量大小在97.4～66.2Kda之间的目的蛋白。对多菌灵代谢过程进行跟踪研究，发现在djl-6接种24小时后有三种中间代谢物存在，分别是2-氨基苯并咪唑（m／z=134.3）、苯并咪唑（m／z=119.3）和一种分子离子峰为104.8和118.5的未知物质。而经过2～3天的培养后，HPLC分析表明100mg．L-1的多菌灵几乎被完全降解。推测多菌灵可能首先被转化为2-氨基苯并咪唑，然后再进一步被转化，最后被完全降解。本研究也是首次发现2-氨基苯并咪唑和苯并咪唑在纯菌多菌灵代谢物中同时存在。djl-6在红壤、潮土和高沙土中的降解实验表明，其在土壤中降解多菌灵需要一定的水分含量，稍高的水分含量有利于其对多菌灵的降解，但完全淹水的条件又会影响到其降解功能的发挥；与最适生长特点相符，在土壤中djl-6适宜的降解pH和温度分别为7.0和30℃；三种土壤中多菌灵的降解主要是由降解菌完成的，且接种量越大降解效果越好；添加葡萄糖对djl-6降解土壤中多菌灵有一定地促进作用。投加多菌灵和djl-6对红壤、潮土和高沙土三种土壤酶活性的影响表明，对过氧化氢酶活性的影响都是加降解菌的酶活要高于未加菌的酶活。未加菌处理初期都表现出抑制现象，而后又缓慢得到恢复；对土壤脱氢酶活性的影响，高沙土和红壤、潮土的实验结果相反，在加菌处理和未加菌处理中脱氢酶活性一开始就表现出抑制现象。其后虽然中间得到了一定的恢复，但仍然低于起始时没有经过任何处理的脱氢酶活性；三种土壤的实验结果都表明，加菌处理和未加菌处理对蔗糖酶和脲酶活性的影响在初期时都表现出抑制作用，其后逐渐恢复。接种降解菌的土壤脲酶活性要高于未接菌土壤的脲酶活性。

论文目录

摘要

Abstract

前言

符号与缩略语

文献综述

第一节农药残留污染现状及其生物修复

一农药的发展历史和生产使用情况

1.农药的发展历史

2.国内外农药的生产、使用情况

二农药残留的污染现状及危害

1.农药的残留现状

2.农药的毒害作用

三农药残留的微生物降解

1.农药在环境中的微生物降解机制

2.农药残留的微生物降解现状

四农药残留的生物修复现状

1.原位（In situ）生物修复技术

2.异位生物修复技术

五多菌灵残留及其微生物降解情况

参考文献

第二节微生物分类方法研究概述

一传统分类法

二化学分类法

2.1 细胞壁组成

2.2 脂肪酸组成分析

2.3 醌组分分析

2.4 全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析

三遗传特征分类法

3.1 细菌G+Cmol%的测定

3.2 DNA-DNA杂交

3.3 RNA同源性分析

四红球菌属分类进展

4.1 红球菌属分类历史

4.2 红球菌属鉴别特征

参考文献

第三节农药污染对土壤生态功能的影响

一化学农药对土壤微生物生物量的影响

二农药污染对土壤生态功能的影响

1.农药污染对土壤呼吸作用的影响

2.化学农药对土壤物质循环的影响

2.1 氨化作用

2.2 硝化作用

2.3 反硝化作用

2.4 固氮作用

3.农药污染对土壤酶活性的影响

3.1 对过氧化氢酶活性的影响

3.2 对脱氢酶活性的影响

3.3 对蔗糖酶活性的影响

3.4 对脲酶活性的影响

参考文献

实验部分

第一章多菌灵降解菌的分离、筛选及鉴定

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

1.2 降解菌的富集和分离

1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定

1.4 降解菌株16S rDNA序列的扩增与分析

1.4.1 菌体总DNA的提取

1.4.2 降解菌株的16S rDNA序列的扩增和酶连

1.4.3 普通感受态细胞的制备和转化

1.5 降解菌株的系统发育分析

1.6 多菌灵含量的测定方法

2 结果与分析

2.1 降解菌株的富集和分离

2.2 降解菌株的形态和培养特征

2.3 降解菌株的生理生化特征

2.4 降解菌株的16S rDNA鉴定

2.5 降解菌株的系统进化分析

2.6 环境条件对降解菌株生长的影响

2.6.1 温度对降解菌株生长的影响

2.6.2 pH值对降解菌株生长的影响

2.6.3 通气量对降解菌株生长的影响

2.6.4 NaCl浓度对降解菌株生长的影响

2.6.5 降解菌株的碳源利用情况

2.6.6 降解菌株的氮源利用情况

2.6.7 降解菌株的抗生素耐受情况

3 本章小结

参考文献

第二章多菌灵降解菌降解特性研究

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基及试剂

1.2 菌株的培养和接种

1.3 土壤浸出液的制备

1.4 多菌灵含量的测定

2 结果与讨论

2.1 降解菌利用多菌灵作为唯一碳氮源利用情况

2.2 温度对降解菌降解多菌灵的影响

2.3 pH值对降解菌降解多菌灵的影响

2.4 盐浓度对降解菌降解多菌灵的影响

2.5 通气量对降解菌降解多菌灵的影响

2.6 接种量对降解菌降解多菌灵的影响

2.7 添加营养物质对降解菌降解多菌灵的影响

2.8 添加金属离子对降解菌降解多菌灵的影响

2.9 降解菌的降解谱

3 本章小结

参考文献

第三章多菌灵降解菌dj1-6分类地位研究

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂

1.2 API鉴定系统分析

1.3 Biolog鉴定系统分析

1.4 菌株多相分类研究

1.4.1 细胞脂肪酸分析

1.4.2 醌组分分析

1.4.3 细胞氨基酸、糖组分分析

1.5 菌株基因型特性分析

1.5.1 菌株G+Cmol%的测定

1.5.2 DNA-DNA同源性测定

2 结果与分析

2.1 生理生化特性比较

2.2 Biolog鉴定结果

2.3 API鉴定结果

2.4 细胞脂肪酸成分分析

2.5 细胞氨基酸、糖组分分析

2.6 菌株醌组分分析

2.7 菌株G+Cmol%含量测定

2.8 菌株DNA-DNA同源性分析

3 本章小结

参考文献

第四章多菌灵降解菌dj1-6酶学特性研究

第一节多菌灵降解酶提取方法研究

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基、试剂及仪器设备

1.2 粗酶液的制备

1.3 降解酶的定位

1.4 降解酶的类型

1.5 蛋白质含量的测定

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线和产酶曲线

2.2 蛋白质标准曲线

2.3 常规提酶方法对提取量和酶活的影响

2.4 降解酶的定域

2.5 降解酶的类型

第二节多菌灵降解酶粗酶液反应体系的建立

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂

1.2 粗酶液的制备

1.3 酶活测定反应体系

2.结果与分析

2.1 pH对多菌灵酶促降解的影响

2.2 温度对酶促降解的影响

2.3 酶的反应进程曲线

2.4 酶浓度曲线

第三节多菌灵降解酶的特性研究

1.材料与方法

1.1 菌种、培养基及试剂

1.2 降解酶的提取方法

1.3 酶活测定的反应体系

2 结果与分析

2.1 降解酶的酸碱稳定性

2.2 降解酶的热稳定性

2.3 金属离子对酶活测定的影响

2.4 表面活性剂对酶活测定的影响

第四节多菌灵降解酶的初步分离纯化

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基及试剂

1.2 降解酶的提取方法

1.3 酶活测定的反应体系

1.4 非变性蛋白质电泳相关试剂、溶液配方

1.5 降解酶的硫酸铵沉淀粗分

1.6 降解酶的考染和酯酶染色

1.7 降解酶的初步分离纯化

2 结果与分析

2.1 降解酶的硫酸铵沉淀粗分

2.2 降解酶的酯酶染色及酶谱分析

2.3 降解酶的初步分离纯化

3 本章小结

参考文献

第五章多菌灵代谢途径分析

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基、试剂

1.2 代谢产物提取方法

1.3 多菌灵HPLC-MS分析

2 结果与分析

2.1 菌株生长和降解的关系

2.2 代谢产物累积的HPLC检测

2.3 代谢产物的HPLC-MS分析

3 本章小结

参考文献

第六章多菌灵降解菌dj1-6应用特性研究

第一节环境条件对dj1-6降解土壤中多菌灵的影响

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基及土样

1.2 土壤中多菌灵及降解菌dj1-6的施用

1.3 土壤中多菌灵的提取及检测

2 结果与分析

2.1 土壤水分含量对降解的影响

2.2 土壤pH值对降解的影响

2.3 土壤温度对降解的影响

2.4 接种量多少对降解的影响

2.5 添加外源有机物质对降解的影响

2.6 灭菌和未灭菌土壤对降解的影响

2.7 淹水和非淹水条件对降解的影响

第二节多菌灵和降解菌的施用对土壤酶活性的影响

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基及土样

1.2 土壤中多菌灵及降解菌dj1-6的施用

1.3 土壤酶活性的检测

1.3.1 土壤过氧化氢酶活性的测定

1.3.2 土壤脱氢酶活性的测定

1.3.3 土壤蔗糖酶活性的测定

1.3.4 土壤脲酶活性的测定

2 结果与分析

2.1 多菌灵的使用对土壤过氧化氢酶活性的影响

2.2 多菌灵的使用对土壤脱氢酶活性的影响

2.3 多菌灵的使用对土壤蔗糖酶活性的影响

2.4 多菌灵的使用对土壤脲酶活性的影响

3 本章小结

参考文献

全文总结

论文创新点

附录1 文中所用培养基及试剂配方

附录2 降解菌株的16S rDNA序列

附录3 攻读博士学位期间发表的文章

致谢

多菌灵降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究

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