稻瘟病菌中硝酸盐利用缺陷型突变体的筛选及相关基因的研究

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）既是经济重要的病原真菌，也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物，从全基因组水平分析研究该菌关键基因的功能，可以加速对稻瘟病菌生物学及其致病分子机制的认识，为培育持久抗病水稻品种和制定稻瘟病菌持续管理的策略提供理论依据。为此，本研究从450个农杆菌介导转化T-DNA的突变体中筛选硝酸盐利用缺陷型突变体，共筛选到6个硝酸盐利用缺陷型突变体，对其中之一T940002002-1-2（5）进行如下的研究：TAIL-PCR扩增得到T-DNA插入侧翼稻瘟病菌基因组序列。Guy11和T940002002-1-2（5）突变体进行有性交配，得到的37个子囊孢子后代，潮霉素的分离比例符合1：1的分离比例，说明可能为单拷贝插入。分析侧翼序列，T-DNA插在推测基因MGG-06042.5启动起始位点ATG上游318bp位置中，推测影响的基因为MGG06042.5。T940002002-1-2（5）、T940000302突变体对C101LACPi-1（t）、C101PKTPi-4a的致病性增强，推测插入的基因可能同时也与稻瘟病菌致病性有关。将29个子囊孢子培养产生的分生孢子接种C101LACPi-1（t）、C101PKTPi-4a，由于亲本Guy11和T940002002-1-2（5）对两个水稻品种均为致病的，接种结果显示后代也均致病的，说明T-DNA插入的基因可能与无毒基因的表达有关，也进一步证明对C101LACPi-1（t）、C101PKTPi-4a的致病性增强的可信性和遗传的稳定性。T940002002-1-2（5）突变体附着胞的形成、洋葱表皮侵入均与野生型没有明显差别，但产孢量下降。本文筛选本实验室的稻瘟病菌T-DNA插入突变体库，获得了六个硝酸盐利用缺陷型突变体，并发现了被标记的基因，是研究稻瘟病菌氮代谢途径以及氮代谢与致病性之间的相互关系奠定了基础，具有重要的科学意义和应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.文献综述
• 1.1 稻瘟病菌
• 1.1.1 稻瘟病菌功能基因组的研究
• 1.1.2 反向遗传学方法
• 1.1.3 T-DNA插入在真菌功能基因组研究上的应用
• 1.2 真菌的氮代谢及其调控机制
• 1.2.1 硝酸盐的同化
• 1.2.2 硝酸根同化基因启动子的分析
• 1.2.3 整体起作用的氮调控基因
• 1.2.4 GATA因子结合DNA
• 1.2.5 AREA和NIT2识别元件
• 1.3 氮代谢的调控和真菌的致病性
• 1.4 稻瘟菌中氮饥饿中基因的表达的最新进展
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素
• 2.1.4 克隆载体和转化载体
• 2.1.5 生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 农杆菌介导T—DNA插入稻瘟病菌突变体的转化与筛选
• 2.2.2 硝酸盐利用缺陷型突变体的筛选方法
• 2.2.3 潮霉素抗性验证
• 2.2.4 稻瘟病菌基因组DNA的提取及提取质量的检测
• 2.2.5 T-DNA插入的分子检测
• 2.2.5.1 普通PCR检测方法
• 2.2.5.2 热不对称嵌套PCR检测方法
• 2.2.6 DNA片段的回收、克隆和测序
• 2.2.6.1 DNA片段的回收
• 2.2.6.2 DNA片段与载体pMD18-T的连接
• 2.2.7 T-DNA插入侧翼序列的测序与插入位点的分析和验证
• 2.2.8 有性交配及子囊孢子后代潮霉素的分离比例
• 2.2.9 孢子萌发及附着胞形成实验
• 2.2.10 洋葱表皮内侵染结构的观察
• 2.2.11 致病性变异测定
• 2.2.12 有性交配的子囊孢子后代致病性的分离比例研究
• 2.2.13 稻瘟病菌原生质体制备和转化
• 06042.5基因敲除突变体的载体构建'>2.2.14 MGG₀6042.5基因敲除突变体的载体构建
• 06042.5基因互补突变体的载体构建'>2.2.15 MGG₀6042.5基因互补突变体的载体构建
• 3.结果与分析
• 3.1 构建的T-DNA插入稻瘟病菌突变体的数目
• 3.2 硝酸盐利用缺陷型突变体的筛选与分析
• 3.2.1 硝酸盐利用缺陷型突变体的筛选
• 3.2.2 对T940002002-1-2（5）突变体的研究
• 3.2.2.1 潮霉素抗性验证
• 3.2.2.2 潮霉素基因片段扩增的验证
• 3.2.2.3 T-DNA插入侧翼序列的扩增
• 3.2.2.4 T-DNA插入侧翼序列及插入基因的分析
• 3.2.2.5 T-DNA序列插入的方式与插入位点的验证
• 3.2.2.6 交配后代潮霉素的分离比例
• 3.2.2.7 突变体的生长与发育变化
• 3.2.2.8 突变体的致病性分析
• 3.2.2.9 有性交配的子囊孢子后代致病性的分离比例研究
• 06042.5基因敲除验证'>3.2.2.10 MGG₀6042.5基因敲除验证
• 06042.5基因功能互补验证'>3.2.2.11 MGG₀6042.5基因功能互补验证
• 4.结论与讨论
• 4.1 突变体的筛选方法
• 4.2 氮代谢相关基因的分析
• 06042.5的功能验证'>4.3 插入基因MGG₀6042.5的功能验证
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢