论文摘要
一研究背景雌激素是正常乳腺发育以及乳腺癌形成过程中发挥重要角色的类固醇激素,在体内通过与不同基因编码的雌激素受体亚型（ERα和ERβ）结合而表现广泛的生物学活性。女性进入绝经期后,体内雌激素水平显著下降,出现绝经期综合症,长期以来临床采用人工合成的雌激素替代治疗（hormone replacement treatment,HRT）缓解妇女绝经期综合征症状。然而HRT所带来的如生殖系统肿瘤及乳腺癌的发生、子宫内膜增生、高血凝状态等不良反应影响其推广应用,1999年美国国立卫生研究院已宣布将人工合雌激素列入致癌“黑名单”。因此,人们致力于寻求雌激素的替代物,期望这种替代物能保留雌激素对心血管系统等保护作用,同时避免上述的不良影响,这类物质被称为选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulators,SERMs）,这些化合物具有双向调节作用:在体内雌激素水平较低时有拟雌激素作用;当体内雌激素水平较高时可发挥抗雌激素活性。来源于植物而且结构类似雌激素的植物雌激素（phytoestrogen,PE）正是其中的重要一类。长期以来,许多中草药植物被广泛应用于妇女保健和妇科病症的治疗,这些中药所含的植物雌激素在其中发挥的药效作用不容忽视。本课题是在课题组通过报告基因技术筛选中药植物雌激素受体调节剂的研究基础上展开的,课题组以往的实验结果表明补骨脂、菟丝子是具有雌激素活性的中药。本实验以二者主要有效成分补骨脂素（Psoralen）和槲皮素（Quercetin）为研究对象,深入研究补骨脂素和槲皮素植物雌激素作用及分子生物学机制。希望从筛选出的具有雌激素样作用的中药中,最终找出具有雌激素样作用的单体化合物,作为人工合成雌激素的代用品。二研究方法本实验以两种人类乳腺癌细胞系（ER阳性细胞株MCF-7、T47D和ER阴性细胞株MDA-MB-231）为模型,以17β-雌二醇（E2）和代表性的植物雌激素金雀异黄素（Genistein）为参照,运用流式细胞术、RT-PCR、蛋白质免疫印记技术、基因芯片技术等方法,从蛋白表达和基因水平系统研究槲皮素、补骨脂素雌激素样作用及其作用机理。三研究结果1槲皮素、补骨脂素对人类乳腺癌细胞增殖作用的实验研究1.1 MTT法测定槲皮素和补骨脂素对人类乳腺癌细胞系细胞增殖的影响1.1.1对雌激素受体阳性乳腺癌细胞系增殖作用影响以10-3μM E2为阳性对照药,金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素三种药物分别在1～50μM不同浓度处理MCF-7、T47D细胞24h、48h、72h。与溶剂对照组相比,10-3μM E2处理24h、48h、72h能促进雌激素受体阳性MCF-7、T47D细胞增殖;与E2相似,金雀异黄素在浓度1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM时处理MCF-7细胞24h、48h、72h促进增殖,在浓度1μM、10μM、20μM时处理T47D细胞24h、48h、72h促进其增殖;槲皮素在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM时处理MCF-7细胞24h促进增殖,浓度1μM处理48h、72h也促进其增殖;在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM时处理T47D细胞24h、48h、72h促进其增殖;补骨脂素在浓度1μM、10μM、20μM、30μM、40μM时处理MCF-7细胞24h、48h、72h促进增殖;在浓度10μM、20μM、30μM、40μM时处理T47D细胞24h、48h、72h促进其增殖。为进一步验证MCF-7细胞的增殖是否通过雌激素受体发生作用,雌二醇组和各浓度药物组同时加入终浓度为10-8mol·L-1ICI182,780共孵育24h。ICI182,780为实验用雌激素受体完全拮抗剂,能完全阻断E2等雌激素样物质由雌激素受体介导的一系列生物效应,包括促增殖作用。10-3μM E2及在1μM～50μM浓度范围内的金雀异黄素、槲皮素和补骨脂素诱导的MCF-7细胞增殖作用被10-8mol·L-1ICI182,780完全拮抗,与溶剂对照组的细胞增殖情况无显著性差异。1.1.2对雌激素受体阴性细胞乳腺癌细胞系增殖作用影响与溶剂对照组相比,10-3μM E2对雌激素受体阴性MDA-MB-231细胞处理24h未见其增殖作用,金雀异黄素、补骨脂素在浓度1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM时对雌激素受体阴性MDA-MB-231细胞处理24h,未见其增殖作用;槲皮素在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM时处理24h而抑制其增殖。1.2流式细胞术检测槲皮素、补骨脂素对MCF-7、T47D处理后细胞周期的变化分别选取金雀异黄素、槲皮素和补骨脂素10μM浓度处理MCF-7、T47D细胞48h,与对照组相比,增殖指数明显升高,S期细胞的比例增加,细胞DNA合成增加,对细胞增殖具有促进作用,与10-3μM E2阳性对照组的变化趋势一致,但作用强度不及阳性对照组,当MCF-7、T47D被ICI182,780分别与E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素共孵育48h后,E2、金雀异黄素、槲皮素、补骨脂素的增殖效应被抑制,细胞周期S期细胞数比例显著下降。2槲皮素和补骨脂素对雌激素受体两种亚型ERα、ERβ的影响2.1槲皮素、补骨脂素对T47D细胞ERα、ERβ基因mRNA转录的影响10μM金雀异黄素、10μM槲皮素和10μM补骨脂素分别处理T47D细胞48h,RT-PCR表达结果显示金雀异黄素、槲皮素和补骨脂素显著诱导T47D细胞ERαmRNA水平。雌二醇、金雀异黄素、槲皮素和补骨脂素对T47D细胞ERβmRNA水平的影响与对照组相比无显著性差异。2.2槲皮素、补骨脂素对MCF-7、T47D细胞ERα、ERβ受体蛋白表达的影响10-3μM E2、10μM金雀异黄素、10μM槲皮素和10μM补骨脂素分别处理MCF-7、T47D细胞48h,western-blot结果显示,均上调MCF-7、T47D细胞ERα蛋白水平,而对ERβ蛋白表达没有明显影响;当与ICI182,780共孵育MCF-7、T47D细胞ERα蛋白表达被拮抗。3金雀异黄素和补骨脂素对人乳腺癌T47D细胞基因表达的实验研究10-3μM E2、10μM金雀异黄素和10μM补骨脂素分别处理ER阳性细胞T47D 48h,应用乳腺癌和雌激素受体信号通路基因芯片研究相关基因表达。细胞周期蛋白基因CCNE1（Cyclin E1）,CCNE2（Cyclin E2）与CCNA2（Cyclin A2）表达显均显著上调;ESR1即ERα基因,雌激素诱导的相关基因PGR,TFF1/PS2,BCL2,ERBB2,C3,CCND1,TEF3,IGFBP2,IGFBP5,GATA3等也分别不同程度的上调。四研究结论1槲皮素、补骨脂素在一定浓度范围内（1～50μM）促进雌激素受体阳性MCF-7和T47D细胞增殖,而且对MCF-7细胞的增殖效应可以被雌激素受体拮抗剂ICI182,780完全拮抗,而对雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231未见显著增殖效应。槲皮素、补骨脂素其增殖效应类似于植物雌激素金雀异黄素。提示槲皮素、补骨脂素是具有雌激素样作用的中药活性成分,其促雌激素受体阳性细胞系增殖作用是通过雌激素受体所介导的。2金雀异黄素、槲皮素和补骨脂素诱导T47D细胞ERαmRNA,而对ERβmRNA水平无明显影响;诱导MCF-7、T47D细胞ERα蛋白表达,而对ERβ受体蛋白的表达无明显影响,而且ICI182,780可拮抗MCF-7、T47D细胞ERα蛋白表达。提示槲皮素、补骨脂素产生的类似金雀异黄素促进ER阳性细胞增殖的雌激素样作用是通过增加ERα表达实现的。3通过基因芯片实验进一步证实补骨脂素具有同金雀异黄素相似的雌激素作用,激活人乳腺癌T47D细胞的ERα受体表达,而且雌激素诱导基因的上调显示补骨脂素同金雀异黄素同属于植物雌激素;通过周期蛋白过表达而调节CDK的活性加速S期进程,促进细胞的增殖。