猪弓形虫病分子诊断方法的建立与基因免疫研究

论文摘要

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的以孕妇（畜）流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童（幼畜）生长受阻、死亡等为特征的人兽共患病。该病广泛存在于世界各地，宿主范围十分广泛，人及大多数动物感染率都较高，是人类优生的大敌，是当今新生儿致畸的四大病因之一。弓形虫病在猪场感染率高，严重影响着养猪业的发展。建立准确快速的诊断方法和研制安全高效疫苗是预防和控制弓形虫病的重要措施。本研究利用原核表达系统，高效表达了弓形虫微线体蛋白3（MIC3）和棒状体蛋白2（ROP2），建立MIC3的ELISA和LAT快速检测方法，构建MIC3真核表达质粒，实现MIC3的真核表达，进行MIC3的基因免疫研究。本研究为猪弓形虫病的免疫诊断和预防控制打下了基础。MIC3和ROP2被认为是弓形虫病诊断和疫苗研究具有极大优势的两种候选分子。MIC3是弓形虫在速殖子、缓殖子及子孢子期都表达的粘附蛋白，与弓形虫入侵宿主细胞密切相关，关于其研究，目前国内外报道极少。本研究根据已知基因序列设计引物，以提取弓形虫RH株的总DNA为模板，通过PCR技术扩增MIC3全长的ORF基因和ROP2的主要基因，构建原核表达质粒pGEX-KG-ROP2和pGEX-KG-MIC3，进行了测序。将这两个序列在GenBank上利用DNA Blast和Protein Blast进行比较，发现它们与GenBank收录的MIC3和ROP2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均达到99％以上：同时在E.coli BL21-CodonPlus中实现了高效表达，表达产物经Western blot检测分析，结果表明原核表达的MIC3和ROP2均具有较强的免疫反应原性。利用纯化的重组蛋白rMIC3替代传统的虫体成份作为诊断抗原建立了ELISA和LAT诊断方法。这两种方法检测猪其它常见病原体阳性血清，结果全为阴性；ELISA和LAT分别能检测到1：640和1：32以上稀释血清中的抗T.gondii特异性抗体；诊断试剂的批内（间）重复试验，ELISA变异系数＜10％，LAT凝集效价不发生变化；在4℃贮存下诊断试剂的保质期均超过6个月。以上结果表明，所建立的两种诊断方法均具有良好的特异性、敏感性、稳定性及较长的保质期（4℃）。利用建立的两种诊断方法监测了猪体内弓形虫抗体水平的动态变化。结果表明：在首次感染的第4～6d，用rMIC3-LAT检测到特异性抗体，第14～16d，用rMIC3-ELISA检测到血清中相应的抗体；第24～31d，ELISA抗体水平达到高峰，随后开始下降，在第64 d时检测不到相应的ELISA抗体，用LAT检测时，第14～31d抗体水平达到高峰，随后也开始下降，至第64 d时仍然能检测到抗体。用这两种诊断方法检测471份猪血清，结果符合率达到92.56％。将MIC3基因和IFN-γ基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）上，构建pcDNA-IFN-γ和pcDNA-MIC3两种质粒，分5组（PBS、pcDNA、pcDNA-IFN-γ、pcDNA-MIC3、pcDNA-IFN-γ+pcDNA-MIC3）分别转染IBRS-2细胞，利用间接ELISA检测表达情况，结果表明pcDNA-MIC3、pcDNA-IFN-γ+pcDNA-MIC3均能在IBRS-2细胞中表达，表达产物位于细胞内，而3个对照组均为阴性。在此基础上，将上述5组质粒以肌肉注射方式间隔2周3次免疫小鼠，结果发现pcDNA-MIC3、pcDNA-IFN-γ+pcDNA-MIC3均能诱导产生较强的细胞免疫和体液免疫反应，pcDNA-IFN-γ+pcDNA-MIC3联合免疫诱导的免疫反应有加强作用，表明peDNA-IFN-γ对pcDNA-MIC3有明显的增强作用，可作为较理想的佐剂使用。随后的攻虫试验结果发现，pcDNA对照组和PBS对照组的小鼠在攻虫后的第5 d开始出现全身病症，在第7.5～9 d全部死亡；pcDNA-IFN-γ组小鼠于第7 d发病，第11 d死亡；而pcDNA-MIC3组和pcDNA-MIC3+pcDNA-IFN-γ组小鼠分别在攻虫后的第15 d和第17 d出现上述症状，第22 d出现眼疾病症，第37 d眼疾症状消失，第45 d时的平均生存率分别为78％和100％。试验结果表明，pcDNA-IFN-γ质粒可使免疫小鼠产生一定的抵抗力，pcDNA-MIC3和pcDNA-MIC3+pcDNA-IFN-γ能使免疫小鼠对致死性T．gondii RH株产生坚强的抵抗力。本研究中rMIC3-ELISA和rMIC3-LAT的诊断方法的建立，解决了目前猪弓形虫病不易快速准确简便诊断的难题，对弓形虫病的临床诊断、疾病控制等均具有重要意义。MIC3的真核表达、基因免疫和动物免疫保护试验的研究结果，为弓形虫病的免疫预防、基因疫苗的进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 弓形虫与弓形虫病的发现及其危害
• 1.1.1 弓形虫与弓形虫病的发现
• 1.1.2 弓形虫病的危害
• 1.1.3 猪弓形虫病与公共卫生的关系
• 1.2 弓形虫的病原学
• 1.2.1 弓形虫分类
• 1.2.2 弓形虫的各期形态结构
• 1.2.3 弓形虫生活史
• 1.2.4 流行病学
• 1.2.5 致病机制
• 1.2.6 抵抗力
• 1.3 弓形虫的主要基因与蛋白质
• 1.3.1 P30基因及其编码蛋白质
• 1.3.2 P22基因及其编码蛋白质
• 1.3.3 ROP1基因及其编码蛋白质
• 1.3.4 ROP2基因及其编码蛋白质
• 1.3.5 MIC1基因及其编码蛋白质
• 1.3.6 MIC3基因及其编码蛋白质
• 1.3.7 GRA4基因及其编码蛋白质
• 1.3.8 GRA6基因及其编码蛋白质
• 1.3.9 GRA7基因及其编码蛋白质
• 1.4 弓形虫病的免疫应答
• 1.4.1 先天性免疫
• 1.4.2 获得性免疫
• 1.5 弓形虫病的预防与治疗
• 1.5.1 弓形虫病的预防
• 1.5.2 弓形虫病的治疗
• 1.6 弓形虫病的诊断方法研究进展
• 1.6.1 病原学检查
• 1.6.2 免疫学检测
• 1.6.3 分子生物学诊断
• 1.6.4 目前我国弓形虫病检测试剂（盒）面临的问题
• 1.7 弓形虫疫苗的研究进展
• 1.7.1 弓形虫全虫疫苗
• 1.7.2 基因工程疫苗
• 1.7.3 核酸疫苗
• 第二章 MIC3及ROP2基因的克隆与原核表达
• 2.1 研究的目的意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 兔抗弓形虫高免血清的制备
• 2.3.2 MIC3、ROP2基因的PCR扩增、克隆及序列测定
• 2.3.3 重组质粒在E.coli中的表达与表达产物分析鉴定
• 2.3.4 表达产物的存在形式
• 2.3.5 最佳诱导表达条件的确定
• 2.3.6 表达产物免疫小鼠试验
• 2.4 讨论
• 2.4.1 克隆基因的选择
• 2.4.2 原核表达载体的选择
• 2.4.3 包涵体的提取和纯化
• 2.4.4 表达产物对Balb／c小鼠的免疫保护
• 2.5 小结
• 第三章 猪弓形虫病rMIC3间接ELISA和LAT诊断方法的建立
• 3.1 研究的目的意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 rMIC3间接ELISA方法的建立
• 3.3.2 rMIC3-LAT方法的建立
• 3.4 讨论
• 3.4.1 rMIC3-ELISA和rMIC3-LAT方法的建立
• 3.4.2 对人工感染T.gondii猪体内特异性抗体的监测
• 3.5 小结
• 第四章 MIC3基因和IFN-γ基因真核表达质粒的构建与基因免疫试验研究
• 4.1 研究的目的意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 MIC3和IFN-γ基因真核表达质粒的构建、表达与检测
• 4.3.2 基因免疫试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 真核表达质粒的构建
• 4.4.2 基因免疫程序的设计
• 4.4.3 真核表达质粒在IBRS-2细胞内的表达
• 4.4.4 基因免疫效果的评价
• 4.5 小结
• 参考文献
• 致谢