论文摘要
背景和目的:随着恶性肿瘤的发生率不断上升,恶性肿瘤已成为急待人类攻克的重大课题。目前,对恶性肿瘤的治疗,除手术、放疗和化疗三大治疗手段外,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为重要的肿瘤辅助治疗方法。正常人的免疫系统能识别和杀死恶性肿瘤细胞,免疫防护能力差或对不正常细胞识别能力差,均能导致癌症的发生率增高。因此,免疫刺激剂和免疫调节剂被认为是潜在的抗癌剂。多糖类就是一种重要的生物反应调节剂。多糖做为一种免疫促进剂不仅能够促进T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞的免疫功能。还能促进细胞因子的合成或提高免疫细胞对细胞因子的敏感性。可用于治疗癌症,并无骨髓抑制等毒性。植物多糖可通过对荷瘤机体的免疫调节作用达到抗肿瘤的效果已得到世界的公认。裂褶菌胞外多糖（Schizophyllan,SPG）是由药用真菌裂褶菌（Schizophyllum communeFries）深层发酵产生的一种中性的胞外多糖,具有β-（1-6）葡萄糖苷分支的β-（1-3）-D葡聚糖结构,主链上每隔3个葡萄糖单元产生一个分支。它具有良好的抗肿瘤活性。裂褶多糖（SPG）作为一种免疫功能调节剂,主要是通过增强机体的免疫功能以杀死或抑制肿瘤细胞。国内外对其免疫作用机制的研究有不少报道。如在体外,10—100μg/mL剂量的SPG能提高刀豆素A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应。拮抗免疫抑制剂氢化可的松对淋巴细胞的增殖反应,增加脾淋巴细胞抗羊红细胞抗体的数量,并能增加迟发型皮肤过敏反应,提高细胞免疫功能。对于实验小鼠,裂褶多糖对S-180的腹水瘤和实体瘤、Lewis肺癌等表现出抑瘤活性。多糖的免疫活性受多方面因素的影响,包括溶解性、分子量、化学结构、给药途径和剂量、提取方法以及受药动物种类等。裂褶多糖已被证明具有良好的抗肿瘤、抗感染,提高免疫力等作用。但国内生产裂褶多糖产品存在着可溶性差,分子量大,效果不肯定等问题。为了提高多糖的免疫调节作用,对多糖进行改性可能会产生一些新的理化性质,有利于对构效关系的阐述,增加其抗肿瘤疗效,是目前多糖研究的热点之一,现已应用多种改性方法,并取得大的进展。羧甲基化作为一种常见的化学反应在淀粉、纤维素等高分子材料的改性中得到了广泛的应用。近年的研究表明,制备一定取代度的羧甲基化多糖往往能够起到增强抗肿瘤活性的作用。本研究首次将较大分子量的裂褶多糖结构进行羧甲基化的不同取代度的改性,使其分子量较小,水溶性好,黏度低,易于制成各种剂型,给药方便,并对其作用机制进行初步探讨,希望通过改性提高其抗肿瘤效果,为开发新型抗肿瘤药物提供理论依据。方法:1.制备羧甲基化裂褶多糖,使用凝胶过滤法测定其分子量。2.用BLCB/C小鼠采用腹腔种植法建立肝癌模型,设立阴性对照组（NS）、阳性对照组（5-Fu）、裂褶多糖组（SPG）、两种不同取代度的羧甲基裂褶多糖组（CM-SPG1、CM-SPG2）。以给药后瘤体大小、瘤重、抑瘤率、组织病理学检查等指标评价改性前后的裂褶多糖作用于荷瘤小鼠的效果。3.以鼠肝癌细胞株H22和人肺癌细胞株GLC-82为对象,设立阴性对照（NS）组、阳性对照组（DDP）、裂褶多糖组（SPG）、两种不同取代度的羧甲基裂褶多糖组（CM-SPG1、CM-SPG2）。依据台盼蓝拒染法和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）操作,以细胞死亡率和OD值评价改性前后裂褶多糖对肿瘤细胞是否具有细胞毒作用。4.肝癌荷瘤小鼠分成4组,设空白对照组（NS组）、阳性对照组（CY组）裂褶多糖组（SPG）和羧甲基化裂褶多糖给药组（CM-SPG1组）。处死前摘眼球取血分离上清,采用放射免疫法测量血清TNF-α、IL-2含量。操作按说明书进行。5.统计学分析采用SPSS11.0统计软件包处理,实际数据以均数±标准差（（?）±s）表示;（1）荷瘤小鼠不同药物组的瘤重比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）。组间两两比较采用LSD法（或SNK法）。p＜0.05时认为存在显著差异。（2）不同时间、不同药物的OD值比较采用4×3析因方差分析（Factorialanalysis）。p＜0.05时认为存在显著差异。（3）不同时间、不同药物的细胞死亡率采用多组率之间的X2检验（Chi-Square Test）。p＜0.05时认为存在显著差异。（4）不同组间血清含量测定采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。组间两两比较采用LSD法（或SNK法）。p＜0.05时认为存在显著差异。结果:1.羧甲基裂褶多糖分子量为1×105Da2.荷瘤小鼠实验结果（1）小鼠瘤重各组瘤重有显著性差异（p＜0.05）;SPG组与CM-SPG1、CM-SPG2表现出显著性差异（p＜0.05）,改性前与改性后的两种取代度裂褶多糖存在显著性差异,改性后瘤重小于改性前瘤重,认为改性后抗肿瘤作用提高;CM-SPG1和CM-SPG2组无显著性差异（p＞0.05）,两种不同取代度的羧甲基裂褶多糖的抑瘤作用无显著性差异。（2）各组抑制率从大到小依次为:5-Fu、CM-SPG1、CM-SPG2、SPG。（3）组织病理学各组肿瘤组织形态相似,均为低分化癌,并浸润骨骼肌组织,都可见凝固性坏死。SPG组和CM-SPG-1组肿瘤细胞相对致密,5-Fu组肿瘤细胞相对疏松,染色浅;凝固性坏死区占比例5-Fu组最大,SPG组次之,CM-SPG-1组最小;凋亡细胞数目5-Fu组最多,CM-SPG-1组次之,SPG组最少;空泡状细胞5-Fu组和CM-SPG-1组都较多,SPG最少;淋巴细胞等炎症细胞浸润结缔组织见于SPG组和CM-SPG-1组,5-Fu组不明显。3.CM-SPG体外作用于肝癌细胞株H22的台盼蓝拒染法所测得的细胞死亡率进行X2检验各组存在显著性差异（p＜0.05）。DDP组死亡率显著高于各组。SPG、CM-SPG1、CM-SPG2、NS组死亡率无显著差异（p＞0.05）。认为改性前后的裂褶多糖在体外均末对肝癌细胞表现出抑制作用,无细胞毒作用。4.CM-SPG体外作用于肺癌细胞株GLC-82的MTT所测的OD值进行析因分析,认为各给药组和DDP对照组有显著性差异（p＜0.05）。与生理盐水给比较各给药组之间无显著性差异（p＞0.05）,改性前和改性后裂褶多糖在体外对肺癌细胞无抑制作用,无细胞毒作用。5.血清TNF-α、IL-2含量各组含量有显著性差异（p＜0.05）;SPG、CM-SPG1组含量显著高于NS组及CY组,CY组显著低于NS组。CM-SPG1组与SPG组含量存在显著性差异（P＜0.05）,CM-SPG1含量高于SPG组。改性后裂褶多糖较改性前免疫力效果增强。结论:1.裂褶多糖可进行羧甲基改性,并减小其分子量。2.裂褶多糖和羧甲基裂褶多糖在体外均无直接杀伤肿瘤细胞作用。3.羧甲基裂褶多糖在肝癌小鼠体内表现出抑瘤作用,抑瘤作用较羧甲基化前有所提高。4.羧甲基裂褶多糖可提高肝癌小鼠TNF-α、IL-2含量,可提高机体免疫力抑制肿瘤生长。
论文目录
相关论文文献
标签：羧甲基化裂褶多糖论文; 肝癌模型论文; 体内作用论文; 体外测试论文;