男性不育相关蛋白MLH1和miR-383在精子发生中的功能研究

论文摘要

男性不育是一个世界范围性的生殖健康问题。更重要的是,近年来研究表明男性不育患者有易发睾丸癌的风险。然而,大部分非梗阻性无精症（NOA）患者的病因不明（特发性不育）,且临床治疗有限。一些研究表明减数分裂同源染色体重组缺陷以及生殖细胞增殖凋亡失衡可能是NOA患者中精子发生停滞的潜在致病因素,但这些缺陷的分子调控机理尚缺乏了解。同源重组过程涉及同源配对染色体间的交换位点（COs,由粗线期MLH1蛋白标记）形成。交换位点的形成确保减数分裂过程中染色体的正确分离。在人类中,COs的分布受正干涉调控,即一个COs的形成会抑制其它COs在它邻近形成,从而使COs沿染色体分散排布。为研究男性交换干涉的程度,本课题采用免疫荧光技术并结合多重彩色荧光原位杂交技术（cenM-FISH）鉴定粗线期特定染色体上COs的频率和位置,并将交换位点间的距离拟合到gamma model中获得干涉参数v用于定量交换干涉的强度。分析结果表明交换干涉可连续通过着丝粒起作用,且交换干涉水平在个体间、染色体间和染色体内均存在显著的变异,即小号染色体的干涉水平强于大号染色体,而臂间干涉强于臂内干涉。此外,SCs对交换干涉水平大小具有重要的调控作用,这主要表现在两方面：1)交换干涉存在染色体间效应,而这种效应与SCs的长度相关,即两长度类似的SCs上交换干涉水平更易发生相互关系；2)染色体结构异常可影响干涉水平,如9号染色体上出现的不连续区域gaps及未联会区域splits可cis/trans影响其本身和其它染色体上干涉水平。本文首次表明交换干涉水平在全基因组范围内存在显著的异质性,且至少在男性中,染色体联会异常可导致交换干涉水平的改变。下一步的目标是鉴定混合型精子发生停滞的NOA患者中缺陷病理发生的信号调控途径。microRNAs （miRNAs）是一类小分子非编码RNA,已有研究报道其在精子发生过程中扮演重要角色。为确定候选的功能性miRNAs,本文首先通过microarray技术筛选正常与不育患者中差异表达的miRNAs,发现154种显著下调及19种显著上调的miRNAs。从中选取下调比较显著的miR-383为研究对象,原位杂交结果显示miR-383主要表达于人精原细胞及初级精母细胞。经real-time PCR分析证实其在精子发生停滞的不育患者中出现显著下调,而这种下调受到转录及转录后水平调控,且与不育患者中生殖细胞过度增殖有关。在睾丸癌细胞系NTera-2 cells中沉默内源的miR-383促进细胞增殖及细胞周期G1/S期转变,同时抑制本底凋亡,而过表达miR-383则出现相反效应。进一步实验表明miR-383通过影响mRNA稳定性靶向转录因子interferon regulatory factor-1 （IRFl）,且miR-383与IRF1在体内存在负相关关系,同时miR-383可抑制IRF1的细胞周期相关靶基因cyclin D1、CDK2及p21表达。沉默内源IRF1或cyclin D1,而非CDK2增强miR-383介导的抑增殖效应。沉默p21则对miR-383介导的抑增殖效应起负反馈调控作用。此外,miR-383可通过提高CDK4的蛋白酶体降解抑制其表达,最终导致G1期关键调控因子pRb磷酸化水平降低。这些研究结果表明miR-383-IRF1-pRb途径异常与不育患者中的精原细胞增殖失调相关,且可能参与介导不育患者的睾丸癌易感性。综上所述,本文描绘了正常情况下MLH1位点交换干涉的分布模式以及miR-383在精原细胞增殖方面所扮演的角色,这些结果有助于进一步探讨NOA患者中增殖凋亡失衡以及同源重组缺陷的原因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 男性不育概述
• 1.2 精子发生过程
• 1.3 减数分裂同源染色体重组与男性不育
• 1.3.1 减数分裂前期Ⅰ过程
• 1.3.2 重组的发生与检测手段
• 1.3.3 重组的特征与调控因素
• 1.3.4 重组缺陷与男性不育
• 1.4 生殖细胞增殖凋亡与男性不育
• 1.4.1 生殖细胞增殖
• 1.4.2 生殖细胞凋亡
• 1.4.3 增殖凋亡与男性不育
• 1.5 研究内容
• 第二章 实验结果与讨论
• 2.1 正常男性同源重组交换位点MLH1的干涉图谱
• 2.1.1 引言
• 2.1.2 研究结果
• 2.1.2.1 交换位点间距离的获取
• 2.1.2.2 交换干涉的特征
• 2.1.2.3 交换干涉在染色体内、染色体间及个体间存在显著变异
• 2.1.2.4 交换干涉存在染色体间效应
• 2.1.2.5 交换干涉强度受联会复合体结构影响
• 2.1.3 结果分析与讨论
• 2.1.4 本节小结
• 2.1.5 实验材料和方法
• 2.1.5.1 实验材料
• 2.1.5.2 实验方法
• 2.2 microRNAs参与男性不育患者中的精子发生障碍
• 2.2.1 引言
• 2.2.2 研究结果
• 2.2.2.1 男性不育患者中生殖细胞出现过增殖现象
• 2.2.2.2 男性不育患者中出现大量异常表达的microRNAs
• 2.2.2.3 异常表达microRNAs的基因组定位
• 2.2.2.4 不育患者中生殖细胞过增殖与miR-383下调相关
• 2.2.2.5 miR-383靶向调控转录因子IRF1表达
• 2.2.2.6 miR-383与IRF1在体内呈负相关
• 2.2.2.7 miR-383调控pRb磷酸化途径
• 2.2.2.8 miR-383-pRb途径参与不育患者中精子发生停滞
• 2.2.3 结果分析与讨论
• 2.2.4 本节小结
• 2.2.5 实验材料和方法
• 2.2.5.1 实验材料
• 2.2.5.2 实验方法
• 2.3 总结和展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果