论文摘要
猴病毒40（Simian virus 40,SV40）是一种DNA肿瘤病毒,在体外可以转化细胞并诱发动物体内产生肿瘤,在人类多种肿瘤中已检测到SV40基因的存在和表达。SV40与人类肿瘤关系密切,它的致瘤性和转化细胞能力主要与其编码的早期蛋白T抗原（T antigen,Tag）有关。SV40Tag能够和抑癌蛋白p53和Rb等结合并使之失活,导致细胞生长失控和恶性增殖,被认为是SV40Tag致瘤发生的重要机制。SV40Tag可以整合入细胞基因组中破坏其结构和稳定性,反式激活细胞基因的表达并启动宿主DNA的复制转录等。SV40Tag对细胞转化起决定性作用,与细胞增殖及肿瘤发生密切相关,它可以诱发转基因动物产生多种类型肿瘤,被广泛用于肿瘤发生机制的研究。利用SV40Tag基因与组织表达特异性的启动子相结合,已经成功制备多种转基因小鼠肿瘤模型。H+/K+ATPase基因在胃壁细胞中特异性表达,利用胃壁细胞特异性H+/K+ATPaseβ亚基启动子建立SV40Tag基因转基因小鼠胃癌模型,可用于胃癌发病机制的研究,同时为胃癌的预防和治疗提供有力的工具。在以往研究的基础上,本实验将H+/K+ATPaseβ亚基启动子驱动表达SV40Tag基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/HKSV转染入SGC7901、EC9706和KB细胞中,通过G418筛选和扩大培养,获得稳定转染的细胞系。应用PCR、RT-PCR和免疫细胞化学染色方法检测SV40Tag基因在稳定转染细胞中的整合与表达情况,并且观察SV40Tag基因的表达对人胃癌细胞SGC7901生物学特性的影响,探讨SV40Tag的作用机制及SV40Tag基因表达与肿瘤发生发展的关系,为进一步转基因动物模型的构建奠定理论及实验基础。材料与方法:1.质粒的扩增、提取和酶切鉴定提取质粒pcDNA3.1（-）、pcDNA3.1（-）/HKSV与pcDNA3.1（-）/SV,利用限制性内切酶酶切鉴定质粒,将质粒用BamHⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.细胞转染利用脂质体LipofectamineTM2000,将含有SV40Tag基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SV和pcDNA3.1（-）/HKSV转染入SGC7901、EC9706和KB细胞中,用G418进行筛选,将获得的阳性细胞克隆扩大培养,得到体外稳定传代的转染细胞系。3.检测稳定转染细胞中SV40Tag基因的表达SV40Tag基因稳定转染后,从DNA、RNA和蛋白质三个水平上检测SV40Tag基因的整合和表达。提取转染及未转染细胞的基因组DNA,利用Tag基因特异性引物PCR扩增检测SV40Tag基因的表达;提取细胞总RNA,RT-PCR检测SV40Tag基因mRNA的表达;免疫细胞化学染色检测稳定转染及未转染细胞中SV40Tag的表达。4.检测转染SV40Tag基因的SGC7901细胞生物学特性变化MTT法检测SV40Tag基因转染前后SGC7901细胞增殖能力变化;应用流式细胞术进行细胞周期分析。5.统计学处理SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理,数值用均数±标准差（（?）±s）表示。应用单因素方差分析进行组间差异比较,以α=0.05为检验水准。结果:1.质粒的酶切鉴定pcDNA3.1（-）/HKSV用BamHⅠ单酶切电泳,可见到约2.7kb与6.4kb两条DNA条带;pcDNA3.1（-）/SV用BamHⅠ单酶切电泳,可见到约2.7kb与5.4kb两条DNA条带;pcDNA3.1（-）用BamHⅠ单酶切电泳,仅见到一条5.4kb的DNA条带,与预期结果相符,可用于下一步的实验。2.PCR各组细胞均可扩增出443bp的内参照GAPDH条带,pcDNA3.1（-）/HKSV与pcDNA3.1（-）/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞均可扩增出618bp的SV40Tag基因特异性条带,未转染细胞与空质粒转染细胞均无此条带出现。3.RT-PCR各组细胞均扩增出443bp的内参照GAPDH条带,pcDNA3.1（-）/HKSV与pcDNA3.1（-）/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞均扩增出272bp的SV40Tag基因特异性条带,未转染细胞与空质粒转染细胞检测不到此条带。4.免疫细胞化学染色pcDNA3.1（-）/HKSV与pcDNA3.1（-）/SV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞中均检测到SV40Tag的阳性表达,未转染细胞与空质粒转染细胞无SV40Tag的表达。5.MTT结果pcDNA3.1（-）/HKSV和pcDNA3.1（-）/SV稳定转染的SGC7901细胞的生长增殖速度比未转染细胞及空质粒转染细胞明显加快,差异有统计学意义（P＜0.05）,未转染细胞和空质粒转染细胞之间差异无统计学意义（P＞0.05）。6.流式细胞术检测细胞周期结果pcDNA3.1（-）/HKSV与pcDNA3.1（-）/SV稳定转染的SGC7901细胞中G1期细胞比例减少及PI指数增加,与未转染SGC7901细胞和空质粒pcDNA3.1（-）转染组细胞相比差异有统计学意义（P＜0.05）,未转染细胞和空质粒转染细胞之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.pcDNA3.1（-）/HKSV稳定转染的SGC7901、EC9706和KB细胞中,SV40Tag基因稳定表达。2.SV40Tag基因的稳定转染促进SGC7901细胞增殖。
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- [2].尿多酸肽对人胃癌细胞SGC7901增殖的体外抑制作用[J]. 现代医药卫生 2008(01)
- [3].马齿苋多糖对胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国癌症防治杂志 2020(04)
- [4].siRNA干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5表达对人胃癌SGC7901细胞增殖和克隆形成能力的影响[J]. 临床肿瘤学杂志 2016(12)
- [5].蛋白酶体抑制剂硼替佐米对胃癌SGC7901细胞的抗肿瘤作用及其机制[J]. 世界华人消化杂志 2011(14)
- [6].胃癌细胞SGC7901体外生长条件的优化研究[J]. 新乡学院学报(自然科学版) 2009(03)
- [7].白杨黄素对人胃癌细胞SGC7901的放疗增敏作用及其相关机制研究[J]. 现代肿瘤医学 2009(09)
- [8].胃癌SGC7901细胞长春新碱耐药性相关miRNA的初步分析[J]. 中国现代医学杂志 2013(18)
- [9].汉黄芩素体外抗人胃癌SGC7901细胞的增殖、凋亡作用[J]. 中国药学杂志 2011(07)
- [10].吴茱萸碱对人胃癌SGC7901细胞增殖、侵袭的影响及机制探讨[J]. 山东医药 2010(34)
- [11].黄芪甲苷对胃癌细胞SGC7901侵袭能力的影响及其机制探讨[J]. 陕西医学杂志 2015(06)
- [12].青藤碱联合氟尿嘧啶对人胃腺癌SGC7901细胞增殖及凋亡的影响[J]. 蚌埠医学院学报 2015(08)
- [13].二氯化钴对胃癌细胞SGC7901凋亡和增殖的影响[J]. 青海医学院学报 2012(02)
- [14].紫杉醇对人胃癌SGC7901细胞株增殖机制影响的实验研究[J]. 中华中医药学刊 2009(12)
- [15].异甘草素对胃癌SGC7901细胞侵袭能力的影响[J]. 天津医药 2015(11)
- [16].阳和汤对裸鼠皮下移植SGC7901抑制作用的实验研究[J]. 临床医药文献电子杂志 2015(24)
- [17].罗格列酮抑制人胃腺癌SGC7901增殖机制的研究[J]. 现代生物医学进展 2013(30)
- [18].沙培林诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及机制的研究[J]. 医学研究生学报 2009(02)
- [19].用红外光谱研究胃癌细胞SGC7901光敏损伤后蛋白质的二级结构[J]. 激光杂志 2010(04)
- [20].吡格列酮对人胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响[J]. 肿瘤药学 2015(04)
- [21].β-榄香烯对人胃癌细胞SGC7901的抑制作用及部分机制[J]. 安徽医科大学学报 2016(12)
- [22].索拉非尼联合顺铂对胃癌SGC7901细胞的抑制作用[J]. 现代生物医学进展 2013(10)
- [23].蟾蜍灵诱导人胃癌SGC7901细胞自噬与凋亡的研究[J]. 现代肿瘤医学 2013(10)
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- [25].姜黄素诱导人胃癌SGC7901细胞自噬性凋亡的研究[J]. 中国现代医学杂志 2012(31)
- [26].大蒜素联合生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞SGC7901生长的影响[J]. 基础医学与临床 2010(11)
- [27].鞣花酸对人胃癌细胞SGC7901的作用研究[J]. 广东化工 2015(08)
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- [29].二氢青蒿素诱导胃癌SGC7901细胞体外自噬研究[J]. 广东医学 2012(22)
- [30].顺铂对人胃癌SGC7901细胞株中干细胞的影响[J]. 中国老年学杂志 2014(13)