乙烯利诱导的橡胶树胶乳cDNA消减文库构建及Etle1基因的克隆与表达分析

论文摘要

为系统解析乙烯利刺激巴西橡胶树橡胶增产的分子机制,本研究应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了乙烯利刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了118个阳性克隆。菌落PCR分析表明,92%左右的阳性克隆含有大小200~500bp的插入片段。随机选取25个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genebank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,5个EST属于无任何序列线索的未知序列,6个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性,剩余的克隆大多是未知功能的推测蛋白基因或未知功能的蛋白基因部分序列的重复克隆。根据生物信息学分析结果,我们对与拟南芥衰老相关的基因SAG102具有较高同源性的克隆EST203进行了研究。利用SMART RACE技术(cDNA末端快速克隆技术)克隆了该基因521bp的全长cDNA。分析结果显示,该基因cDNA拥有144bp的3’端UTR和107bp的5’端UTR,具有270bp完整阅读框架,编码89个氨基酸的蛋白。EtIe1基因结构表明它具有两个外显子序列,在两个外显子中间含158bp的内含子序列。结构域分析结果显示,该蛋白具有一个未知功能的结构域DUF581,暗示该基因可能为一个新的未知功能基因。BLASTN和BLASTX分析结果表明,该基因与拟南芥衰老相关基因SAG102的核苷酸同源性为45%,氨基酸同源性为48.9%。应用半定量PCR技术,我们对该基因在乙烯利刺激割胶条件下的表达情况进行了分析。结果表明,不施用乙烯利的胶乳中,该基因不表达,常规乙烯利刺激割胶条件下,该基因在24小时范围内随处理时间的增加而表达量增强。这表明,该基因的表达受到乙烯利的诱导,为乙烯利诱导特异表达基因,我们将该基因命名为EtIe1(乙烯利诱导表达基因)。乙烯利刺激在促进橡胶树增产的同时,还加速了橡胶树和乳管衰老,我们推测该基因可能参与乙烯利刺激促进橡胶树乳管衰老的过程。对该基因功能的解析及深入研究,将有助于我们了解乙烯利刺激橡胶树信号转导的分子调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1.1 橡胶树及橡胶生产
• 1.2 乙烯利与胶乳增产生理及分子生物学研究
• 1.2.1 乙烯在植物生理中作用及其合成
• 1.2.2 乙烯信号转导研究
• 1.2.3 乙烯利与胶乳增产生理学研究
• 1.2.4 乙烯利与胶乳增产分子生物学研究
• 1.3 差异表达基因的分离策略
• 1.3.1 差别杂交
• 1.3.2 扣除杂交
• 1.3.3 与PCR 技术相关的几种分离策略
• 1.4 SMART RACE 扩增技术
• 1.4.1 SMART CDNA 合成的机制
• 1.4.2 SMART RACE 机制的流程
• 1.4.3 SMART RACE 构建全长CDNA 的流程（图9）
• 1.4.4 SMART RACE CDNA AMPLIFICATION KIT 的优点
• 1.5 基因表达分析技术
• 1.5.1 RT-PCR 的原理及用于基因表达的研究
• 1.5.2 基因芯片在基因表达研究中的应用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 技术路线
• 第二部分 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 试剂
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 橡胶树胶乳总RNA 的提取
• 2.2.2 RNA 电泳检测
• 2.2.3 MRNA 纯化
• 2.2.4 SSH 差减文库的构建
• 2.2.5 差减文库构建及菌落PCR 产物筛选
• 2.2.6 RACE 获得感兴趣片段CDNA 全长
• 2.2.7 ETIE1 基因的获得
• 2.2.8 对ETIE1 CDNA 半定量分析其表达
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 胶乳总RNA 提取与质量检测
• 3.2 胶乳CDNA 的2 次差减杂交和抑制性PCR
• 3.3 胶乳抑制性差减CDNA 文库的构建及PCR 检测
• 3.4 EST（EXPRESSION SEQUENCE TAG，表达序列标签）片段的测序和同源性分析
• 3.5 3’RACE 结果
• 3.6 5’RACE 结果
• 3.7 全长CDNA 的获得
• 3.8 ETIE1 基因结构的获得
• 3.9 CDNA 基因结构和序列比较分析
• 3.9.1 ORF 结构分析
• 3.9.2 BLASTN 结果
• 3.9.3 BLASTX 结果
• 3.9.4 结构域分析
• 3.9.5 ETIE1 基因结构分析
• 3.10 ETIE1 CDNA 的差异表达分析
• 第四部分 讨论
• 4.1 胶乳CDNA 消减文库的构建及初步分析
• 4.2 ETIE1 基因结构、表达分析及可能的功能
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢