棒状链霉菌扩环酶分子改造及Bacillus subtilis FS1403耐热脂肪酶的研究

论文摘要

脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶（扩环酶）是一种依赖Fe2+和a-酮戊二酸的氧化酶,我们的目的是通过酶分子改造提高其对非天然底物青霉素G的催化能力,使改造后的扩环酶成为生物法生产7-ADCA的一种重要工业用酶。我们采用定点突变技术和定向进化技术相结合的方法对脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶底物专一性的定向改造进行探索。本试验在空间结构模拟分析与前人研究的基础上,利用定点突变技术,对棒状链霉菌扩环酶基因的C155、V275、C281、Y184、C37、Q121、A61进行了定点突变。定点突变后分别测试了这些突变体酶对青霉素G的转化活力,得到了对青霉素G有较强催化活性的优良突变体。突变点C155Y、V275I、C281Y、Y184H、Q121M对扩环酶底物专一性的改造有明显的促进作用,而C37S、A61E反而有所降低。我们获得的C155Y+V275I+C281Y+Y184H+C37S+Q121M突变株相对于野生型scDAOCS对青霉素G催化能力提高7.43倍。为了进一步增加该酶对青霉素G的催化能力,采用定向进化技术,以棒状链霉菌scDAOCS为模板进行易错（error-prone）PCR,并以两种来源的扩环酶基因为模版进行DNA改组（DNA shuffling）。将获得的30多个可能含突变体扩环酶的克隆用生物检测的方法检测,但没有得到酶活提高的克隆。为从极端环境微生物寻找特殊性质的酶资源,从菲律宾火山口土样中分离出来的5株耐热菌中筛选得到一株耐热脂肪酶产生菌FS1403,对该菌进行16SrDNA分子鉴定,同源性分析表明该菌与Bacillus subtilis具有最紧密亲缘关系。利用PCR技术克隆该脂肪酶基因并建立pET-28a-lip/BL21表达体系,经SDS-PAGE电泳分析及三丁酸甘油酯平板鉴定,表明该耐热脂肪酶在大肠杆菌中成功实现异源表达。对重组菌脂肪酶酶学特性的初步分析表明,该脂肪酶在pH8.0时,50℃条件下酶活最高,表明该酶具有中度耐热能力,有关结果为今后对脂肪酶进行分子改造提供新的脂肪酶基因资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 理性设计
• 1.1.1 寡核苷酸引物介导的定点突变
• 1.1.1.1 寡核苷酸引物介导的定点突变方法的原理和方法
• 1.1.1.2 改良的寡核苷酸引物所介导的定点突变方法
• 1.1.2 PCR介导的定点突变
• 1.1.2.1 重叠延伸PCR
• 1.1.2.2 大引物突变法
• 1.1.2.3 盒式突变
• 1.2 非理性设计——酶分子定向进化技术
• 1.2.1 酶分子定向进化的历史
• 1.2.2 酶分子定向进化的策略
• 1.2.2.1 易错PCR技术
• 1.2.2.2 DNA改组技术
• 1.2.2.3 外显子改组
• 1.2.2.4 交错延伸重组
• 1.2.2.5 随机引物体外重组
• 1.2.2.6 酶法体外随机-定位诱变
• 1.2.2.7 合成改组
• 1.2.2.8 截断状模板重组延伸
• 1.2.2.9 退火低核苷酸基因重排
• 1.2.2.10 非依赖序列同源性的重组法
• 1.2.3 定向进化文库的筛选方法
• 1.2.3.1 常规筛选方法
• 1.2.3.2 新发展的高效筛选方法
• 1.3 酶分子工程的应用和发展前景
• 1.3.1 提高酶分子的催化活性
• 1.3.2 提高酶分子稳定性
• 1.3.3 微生物酶分子对底物的专一性的定向改造
• 1.3.4 对映体选择性的定向进化
• 1.3.5 对蛋白药物的改造
• 1.4 本课题研究背景
• 1.5 本课题研究内容和意义
• 1.5.1 本课题研究内容
• 1.5.2 本课题研究的目的和意义
• 第2章 棒状链霉菌扩环酶基因的定点突变
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌株和质粒
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.1.3 培养基以及缓冲液
• 2.2.1.4 主要仪器
• 2.2.1.5 定点突变引物
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 大肠杆菌重组质粒pET30a-scDAOC的提取
• 2.2.2.2 定点突变的PCR条件
• 2.2.2.3 感受态E.coli JM109/E.coli BL21的制备
• 2.2.2.4 PCR产物的热激转化
• 2.2.2.5 阳性克隆子的快速筛选与验证
• 2.2.2.6 野生型和突变体的表达转化
• 2.2.2.7 突变体生物活性的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 定点突变的PCR条件的摸索
• 2.3.2 阳性克隆子的快速筛选与验证
• 2.3.3 突变体的测序验证
• 2.3.4 野生型和突变体的SDS-PAGE检测
• 2.3.5 标准蛋白曲线的绘制
• 2.3.6 野生型和突变体的抑菌圈测定
• 2.3.7 野生型和突变体的HPLC测定酶活
• 2.4 小结
• 第3章 棒状链霉菌扩环酶基因随机突变的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 菌株和质粒
• 3.2.1.2 试剂
• 3.2.1.3 培养基以及缓冲液
• 3.2.1.4 主要仪器
• 3.2.1.5 易错PCR和DNA改组的引物
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 棒状链霉菌扩环酶基因的Error-prone PCR
• 3.2.2.2 DNA改组探索
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Error-prone PCR
• 3.3.1.1 Error-prone PCR条件优化
• 3.3.1.2 菌落PCR验证阳性克隆子并测序分析
• 3.3.1.3 易错PCR产物的表达转化以及酶切鉴定
• 3.3.1.4 Error-prone PCR的突变基因库表达和酶活检测
• 3.3.2 DNA改组探索
• 3.3.2.1 链霉菌和真菌扩环酶摸板的大量扩增
• 3.3.2.2 目的基因的随机片段化
• 3.3.2.3 无引物PCR重组
• 3.3.2.4 有引物PCR
• 3.3.2.5 PCR产物的测序验证
• 3.4 小结
• 第4章 耐热脂肪酶产生菌FS1403的分离筛选和16SrDNA基因序列的分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 菌株和质粒
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.1.3 培养基
• 4.2.1.4 仪器
• 4.2.1.5 引物
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 嗜热菌的分离培养
• 4.2.2.2 产脂肪酶耐热菌株的筛选
• 4.2.2.3 产脂肪酶菌株耐热性试验
• 4.2.2.4 FS1403脂肪酶性质的初步研究
• 4.2.2.5 基因组DNA的提取
• 4.2.2.6 16SrDNA基因获得
• 4.2.2.7 16SrDNA基因的连接转化
• 4.2.2.8 16SrDNA基因阳性克隆子的菌落PCR鉴定
• 4.2.2.9 16SrDNA序列分析和进化树构建
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 产脂肪酶耐热菌株的筛选
• 4.3.2 FS1403脂肪酶性质的初步研究
• 4.3.2.1 FS1403脂肪酶活性测定
• 4.3.2.2 FS1403脂肪酶作用温度和作用pH
• 4.3.2.3 温度对FS1403脂肪酶热稳定性的影响
• 4.3.3 FS1403基因组DNA的提取
• 4.3.4 FS1403 16SrDNA基因获得
• 4.3.5 FS1403 16SrDNA基因阳性克隆子的筛选与验证
• 4.3.6 FS1403 16SrDNA基因测序结果
• 4.3.7 FS1403 16SrDNA基因系统进化树分析
• 4.4 小结
• 第5章 Bacillus subtilis FS1403耐热脂肪酶基因的克隆和表达
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 菌株和质粒
• 5.2.1.2 工具酶和生化试剂
• 5.2.1.3 培养基及缓冲液
• 5.2.1.4 引物
• 5.2.1.5 主要仪器设备
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 菌株基因组DNA的提取
• 5.2.2.2 脂肪酶基因的获得
• 5.2.2.3 脂肪酶基因的回收
• 2法制备宿主菌E.coli JM109、E.coli BL21感受态细胞'>5.2.2.4 CaCl₂法制备宿主菌E.coli JM109、E.coli BL21感受态细胞
• 5.2.2.5 脂肪酶基因的克隆
• 5.2.2.6 脂肪酶基因阳性克隆子的菌落PCR鉴定
• 5.2.2.7 脂肪酶基因序列的测定
• 5.2.2.8 重组表达质粒的构建及鉴定
• 5.2.2.9 脂肪酶基因在原核表达载体中的表达
• 5.2.2.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 5.2.2.11 重组枯草芽孢杆菌耐热脂肪酶酶学性质的初步研究
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 基因组DNA的提取
• 5.3.2 目的基因PCR扩增
• 5.3.3 克隆与重组子的鉴定
• 5.3.4 脂肪酶基因的测序结果
• 5.3.5 脂肪酶序列的结构分析
• 5.3.5.1 基因序列的分析
• 5.3.5.2 编码蛋白的预测及分析
• 5.3.6 原核表达载体的构建与鉴定
• 5.3.7 表达产物的电泳结果
• 5.3.8 重组芽孢杆菌耐热脂肪酶酶学性质的初步鉴定
• 5.3.8.1 重组菌脂肪酶的活性鉴定
• 5.3.8.2 温度对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响
• 5.3.8.3 pH对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响
• 5.3.8.4 温度对重组菌脂肪酶热稳定性的影响
• 5.4 小结
• 总结与展望
• 附录 主要符号对照表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历