论文摘要
抑郁症是临床上常见的疾病,各种抑郁症的患病人数约占全球总人口的11%左右。抑郁症已经成为自杀的主要原因之一。现在临床上疗效较好的抗抑郁药物均为进口药物,为研究具有我国自主知识产权的新型抗抑郁药物,本论文进行了三方面的研究：①全化学合成新结构化合物：5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）双重再摄取抑制剂是目前临床上治疗抑郁症效果最好的一类抗抑郁药。中国医学科学院药物研究所杨光中教授课题组在对不同结构类型的22利,5-HT再摄取抑制剂和19种NE再摄取抑制剂研究的基础上,采用计算机辅助设计技术建立了二者的药效团模型,并设计合成了3种全新结构类型的225个化合物。所有化合物通过大鼠脑突触体[3H]-5-HT再摄取抑制实验和[3H]-NE再摄取抑制实验进行了单一摩尔浓度水平（10-5 mol/L）抑制百分率的测定,对抑制活性较强的82个化合物进了再摄取抑制实验IC50测定以及单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）活性抑制率测定。选出体外实验中活性较好的17个化合物,通过小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验评价其抗抑郁活性,通过小鼠自由活动实验鉴别是否具有精神兴奋作用。体外实验结果表明,225个新合成的5-HT和NE再摄取抑制剂类化合物中,有35个化合物能够显著抑制5-HT再摄取,18个化合物显著抑制NE再摄取,5个化合物显著抑制MAO活性；体内活性评价结果显示,17个化合物中有5个化合物YQFO114、YYJ0446、YQF0237、YYJ0318和YWH05011在10 mg/kg（i.p.）剂量下,在小鼠悬尾或小鼠强迫游泳实验中明显缩短小鼠不动时间,具有良好的抗抑郁活性。其中YQF0237抗抑郁作用最佳,具有研发成为新型抗抑郁药的前景。②天然植物提取物：基于中国丰富的天然药物的使用基础,有研究显示青阳参总苷具有抗抑郁活性,我们评价了其同属植物黔产民族药隔山消（Cynanchum auriculatum）的有效部位及有效成分的抗抑郁活性。由贵州师范大学杨庆雄教授课题组提供隔山消提取物,我们以盐酸度洛西汀为阳性对照药,采用大鼠脑突触体[3H]-5-HT再摄取抑制实验在单一摩尔浓度水平（10-5 mol/L）对6个隔山消提取物和20个单体化合物进行了[3H]-5-HT再摄取活性抑制率的测定；采用小鼠悬尾实验和强迫游泳实验对提取物进行了抗抑郁活性的测定,并通过小鼠自主活动实验观察其抗抑郁有效剂量下对中枢神经系统的影响。隔山消提取物中隔山消苷A （TG-A）和隔山消苜B （TG-B）具有较强的抑制大鼠脑突触体5-HT再摄取的作用,其IC50分别为5.2×10-6mol/L和5.0×10-6mol/L。体内活性评价结果显示,与溶剂对照组相比,隔山消提取物TGC及其组分TGC-D和TGC-E （80 mg/kg, i.g.）能够显著缩短小鼠悬尾不动时间（P<0.05）; TGC （80 mg/kg, i.g.）、TGC-D （80 mg/kg, i.g.）和TGC-E （20 mg/kg, i.g.）能够显著缩短小鼠强迫游泳的不动时间（P<0.05或P<0.01）; TGC、TGC-D和TGC-E均未增加小鼠自主活动总路程,提示其在抗抑郁剂量的有效范围内无中枢兴奋作用。我们首次发现隔山消总苷TGC及其组分TGC-D和TGC-E在小鼠悬尾和小鼠强迫游泳实验模型上有明确的抗抑郁作用,TGC-E （TG-A和TG-B的上游部位）的抗抑郁作用机制可能与5-HT再摄取抑制途径相关。本研究为从隔山消中开发新型抗抑郁药物提供了实验依据,对深度利用民族药用植物资源具有重要意义。③老药新适应证：在胆碱能受体拮抗剂东莨菪碱具有抗抑郁活性的临床报道启发下,本研究评价东莨菪碱在小鼠悬尾和强迫游泳模型上的抗抑郁活性及其有效剂量,并通过小鼠自主活动实验观察其抗抑郁有效剂量下对中枢神经系统的影响,通过小鼠跳台实验观察其抗抑郁有效剂量下对学习记忆功能的影响。与溶剂对照组相比,东莨菪碱在0.1-0.4 mg/kg剂量下能够显著缩短小鼠悬尾实验的不动时间（P<0.01或P<0.001）,并显著缩短小鼠强迫游泳实验的不动时间（P<0.001）,且在跳台实验中对小鼠跳台潜伏期和错误次数无明显影响；0.1和0.2 mg/kg剂量下在自主活动实验中对小鼠自主活动无明显影响,0.4 mg/kg剂量下显著增加小鼠自主活动。由此提示,东莨菪碱具有良好的抗抑郁作用,0.1和0.2 mg/kg是其抗抑郁的最佳有效剂量,且在此剂量下对学习记忆能力无损伤,其作用靶点可能与胆碱能系统有关,为今后以东莨菪碱为基础研发新型抗抑郁药物或基于胆碱能系统为靶点寻找和开发新型抗抑郁药物提供了依据。胃溃疡是一种常见病、多发病、极易复发的慢性病,已成为药学领域研究的重点课题之一。治疗胃溃疡的研究靶点越来越广泛,不再局限于抑酸等传统途径,吗啡等作用于中枢神经系统的药物用于治疗胃溃疡成为研究的新方向。目的确证抗抑郁药保护胃黏膜损伤的作用,从神经递质-HPA轴-炎症免疫调节三条通路探索抗抑郁药盐酸度洛西汀保护应激性胃黏膜损伤的作用机制。方法本研究通过三种动物模型（水浸拘束致大鼠胃溃疡、吲哚美辛致大鼠胃溃疡以及利血平致大鼠胃溃疡）评价了四种不同作用机制的抗抑郁药物（5-HT和NE双重再摄取抑制剂盐酸度洛西汀、三环类抗抑郁药阿米替林、选择性5-HT再摄取抑制剂氟西汀以及特异性NE能和5-HT能抗抑郁药米氮平）的抗溃疡作用；为确证老药的新用途,本研究通过病理切片观察确证了盐酸度洛西汀保护应激性胃黏膜损伤的作用；为研究其抗溃疡的作用机制,本研究首先从其作用靶点出发,通过高效液相-电化学（HPLC-ECD）法检测了盐酸度洛西汀对下丘脑、皮层、胃以及血小板中NE、5-HT和5-HIAA含量的影响,并通过拮抗实验分别用α、β肾上腺素能受体拮抗剂卡维地洛阻断NE功能、用5-HT合成抑制剂对氯苯丙氨酸阻断5-HT功能,在该条件下观察对盐酸度洛西汀保护胃黏膜作用及神经递质调节的影响,分析在盐酸度洛西汀保护胃黏膜损伤作用中NE和5-HT系统功能的调节机制；本研究进一步从应激性应答的机理出发,通过ELISA法检测应激6h大鼠下丘脑内促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）的含量以及水浸拘束应激不同时间（15 min、30 min、1h、3h和6h）大鼠的血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）含量,探索在盐酸度洛西汀保护应激性胃黏膜损伤作用中HPA轴通路调节的机制：此外,本研究从应激性胃黏膜损伤的病理机制出发,通过细胞计数法检测了应激大鼠全血中炎性细胞的含量,通过细胞因子抗体芯片法检测了胃黏膜内细胞因子的含量,探索在盐酸度洛西汀保护应激性胃黏膜损伤作用中炎症免疫通路的调节机制。结果①四种抗抑郁药物盐酸度洛西汀、阿米替林、氟西汀和米氮平在5-20mg/kg （i.p.）剂量范围内在水浸拘束、吲哚美辛、利血平诱导的大鼠胃溃疡模型上表现出减少胃黏膜溃疡指数和出血评分的作用。②水浸（21±1℃）拘束应激15 mmin、30 min、1h、3h和6 h,随着应激时间的延长,肉眼观察大鼠胃黏膜损伤逐渐加重,出血增多；病理HE染色观察显示胃黏膜细胞脱落逐渐加重、腺体形态改变、炎性细胞浸润、出血以及火山口样溃疡；盐酸度洛西汀可以有效逆转水浸拘束6h导致的胃黏膜病理变化,维持胃黏膜结构的完整。③水浸拘束应激导致大鼠下丘脑内NE含量显著降低,5-HT和5-HIAA含量显著升高,5-HIAA/5-HT升高；与应激大鼠相比,盐酸度洛西汀能够增加大鼠下丘脑内NE和5-HT含量,减少5-HIAA/5-HT。④水浸拘束应激对大鼠皮层内NE和5-HT含量无明显影响,5-HIAA含量增加；与应激大鼠相比,盐酸度洛西汀对大鼠皮层内NE含量无明显影响,但能够显著增加5-HT含量,减少5-HIAA含量,减少5-HT代谢。⑤水浸拘束应激能够减少胃壁内5-HT和5-HIAA含量；与应激大鼠相比,盐酸度洛西汀能够增加胃壁内5-HT和5-HIAA含量；应激未对大鼠血小板内5-HT含量产生影响；与应激大鼠相比,盐酸度洛西汀对应激大鼠血小板内5-HT含量无明显影响。⑥α、β肾上腺素能受体拮抗剂卡维地洛不能拮抗盐酸度洛西汀保护胃黏膜损伤的作用：单独使用卡维地洛对水浸拘束应激诱导的胃黏膜损伤有一定的保护作用,但弱于盐酸度洛西汀。与应激大鼠相比,单独给予卡维地洛对大鼠下丘脑和皮层内NE和5-HT含量无明显影响,一定程度上减少下丘脑和皮层内5-HIAA含量；盐酸度洛西汀或盐酸度洛西汀+卡维地洛组大鼠下丘脑或皮层内NE和5-HT含量增加,5-HIAA含量显著减少。⑦5-HT合成抑制剂p-CPA不能拮抗盐酸度洛西汀保护胃黏膜损伤的作用；单独使用p-CPA对水浸拘束应激诱导的胃黏膜损伤不具有保护作用。与应激大鼠相比,单独给予p-CPA或者与p-CPA+盐酸度洛西汀组大鼠下丘脑内NE含量无明显变化,皮层内NE含量有一定程度的下降、下丘脑和皮层5-HT和5-HIAA含量下降,而盐酸度洛西汀组大鼠下丘脑和皮层内NE和5-HT含量增加、5-HIAA含量下降。⑧与溶剂对照组相比,水浸拘束6h后大鼠胃黏膜损伤显著增加,大鼠下丘脑内CRF含量明显增加,提示胃黏膜损伤与HPA轴激活之间的相关性；水浸拘束应激15 min、30 min、1h、3h和6h组大鼠血清ACTH含量明显增加,增加率为315%-365%；血清CORT含量明显减少,减少率为46%-58%,ACTH与CORT含量并未随水浸拘束时间的延长而持续增高或降低,盐酸度洛西汀能够减轻应激诱导的大鼠下丘脑CRF含量和血清ACTH含量的增加,并减少血清CORT含量。⑨与溶剂对照组大鼠相比,应激模型组大鼠自细胞、淋巴细胞、中间细胞显著增加131.9%、36.0%和380.3%；与应激模型组大鼠相比,盐酸度洛西汀组大鼠白细胞、淋巴细胞和中间细胞数目显著下降,改善率分别为41.9%、70.1%和59.3%。⑩与溶剂对照组大鼠相比,应激组大鼠胃黏膜内中性粒细胞趋化因子CINC-2a和CINC-3、细胞凋亡因子配体Fas Ligand、胸腺趋化因子Thymus Chemokine-1含量增加,增加率分别为66.0%、84.2%、81.8%和942.0%；与应激组大鼠相比,盐酸度洛西汀20 mg/kg能显著逆转应激诱导的上述4个因子含量的增加,改善率分别为75.3%、103.4%、129.6%和790%。与溶剂对照组大鼠相比,应激组大鼠胃黏膜内T细胞粘附分子ICAM-1、白细胞粘附分子L-Selectin和催乳激素释放因子Prolactin R含量减少,减少率分别为78.5%、76.0%和62.6%；与应激组大鼠相比,盐酸度洛西汀20 mg/kg能显著逆转应激诱导的上述3个因子含量的减少,改善率分别为47.3%、56.8%和51.9%。结论四种抗抑郁药物盐酸度洛西汀、阿米替林、氟西汀和米氮平在5-20mg/kg （i.p.）剂量范围内在水浸拘束、吲哚美辛、利血平诱导的大鼠胃溃疡模型上具有良好的保护作用。盐酸度洛西汀（20 mg/kg, i.p.）可以有效逆转水浸（21±1℃）拘束6h导致的胃黏膜的病理变化,逆转应激引起的黏膜组织结构破坏,维持黏膜细胞和腺体的正常形态,确证其具有良好的保护胃黏膜损伤的作用。盐酸度洛西汀可能通过对神经递质、下丘脑-垂体-肾上腺轴以及炎症免疫三条通路的调节产生了良好的保护胃黏膜损伤的作用,其作用机制为：①通过上调下丘脑或皮层内NE和5-HT含量,逆转应激诱导的胃壁5-HT含量降低,从而增强NE和5-HT功能；②通过减少应激诱导的大鼠下丘脑CRF含量和血清ACTH含量的增加,减少血清皮质酮含量,从而减弱HPA轴的激活；③通过减少应激诱导的胃黏膜细胞凋亡因子配体Fas Ligand以及炎性细胞趋化因子CINC-2α、CINC-3和胸腺趋化因子Thymus Chemokine-1含量的上调从而减少黏膜细胞的凋亡和炎性细胞的募集,减轻胃黏膜局部的炎症反应,通过减少应激诱导的机体淋巴细胞以及中间细胞等炎性细胞数目的增加,从而减弱应激导致的炎症免疫反应。本研究为抗抑郁药物治疗胃溃疡提供了实验依据,为临床上更加充分合理的使用盐酸度洛西汀提供了新思路,同付有助于深入阐明应激致胃溃疡的发病机制,为新型抗溃疡药物的研究提供新方向。
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