水稻抗白叶枯病基因Xa23的分子标记定位及基因组文库构建

论文摘要

水稻抗白叶枯病基因Xa23是从我国普通野生稻（Oryza rufipogon）中鉴定出来的优良基因,对国内外鉴别菌系表现为高抗、完全显性和全生育期抗病。为了克隆Xa23基因,本实验室构建了含2562个单株的F2作图群体,并将Xa23定位在水稻第11染色体长臂上。 本文针对Xa23基因的进一步分子定位和克隆,开展了系列研究,取得了主要结果如下: 1.选取第11染色体长臂G257至G1465区间的15个RFLP探针进行亲本间多态性分析,共6个标记在亲本之间存在多态性,其中探针C1003A距Xa23基因最近,两者间遗传图距为0.4cM。 2.由于分子标记辅助选择育种的需要,将标记C1003A转化为STS标记STS03,为育种学家提供稳定、方便的分子标记。 3.以CBB23黄化苗为材料,以pYLTAC68HB为载体,构建了TAC基因组文库。该文库由68736个克隆构成,插入片段平均大小为32kb,约覆盖水稻基因组5.1倍。 4.根据国际水稻基因组测序计划公布的水稻日本晴第11染色体长臂上的测序结果,本研究以C1003A序列和RM206引物信息进行BLAST比对,建立了跨Xa23基因等位位点的跨叠克隆群。以跨叠克隆群序列设计特异引物31对,经PCR扩增获得了更紧密连锁的标记A89a2、AK601、CF20和A83b4。其中A89a2和AK601与C1003A均位于Xa23的近着丝粒一侧,而CF20和A83b4位于另一侧,这些标记距Xa23基因的遗传距离分别为0.4、0.2、0.2和0.4cM。 5.利用IR24和CBB23杂交构建的共1076个单株的F2群体,菌系P6鉴定表明,F2群体的抗感反应非常清晰。将标记STS03和A83b4进行全部F2植株的检测,表明将Xa23定位于标记STS03和A83b4之间是正确的。由于JG30和IR24有着不同的遗传背景,筛选了在JG30/CBB23之间没有多态性的引物,又获得了4个更紧密连锁的标记,分别是A8A、A8C、CF6、LJ478。将在标记STS03和A83b4之间发生交换的F2植株种植其F3代家系,接种鉴定表明F3代群体的抗/感分离比例完全符合预期值。结合JG30/CBB23群体的定位结果,将Xa23定位于标记AK601和CF20之间。 6.将BAC克隆608用Sau3A I内切酶不完全消化连接到表达载体pCAMBIA130和pYLTAC747HB,构建了两套亚克隆文库,分别挑取了重组子396个和200个,其插入外源片段大小分别为为6～12kb和10～25kb。 7.使用RiceGAAS软件对阳性BAC克隆序列进行基因预测,确定ORF4、5、6、7和8是候选基因。筛选pCAMBIA亚克隆文库,获得了分别包含有ORF4、5、7和8完整序列的表达载体克隆,其中ORF6编码区较大,没有获得包含完整序列的克隆。经农杆菌遗传转化共获得了转ORF4、5、7和8的共1180株的转基因植株,经菌系P6接种鉴定表明这些转基因植株均没有抗性。 8.使用RNAi载体pCK303构建了候选基因的7个RNAi载体,将不同ORF的RNAi载体遗传转化到携有Xa23的粳稻中野19号和籼稻CBB23,目前已经获得了转RNAi植株,有待于进一步接种鉴定。

论文目录

• 英文缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗病基因研究进展
• 1.1.1 植物抗病反应与基因对基因学说
• 1.1.2 植物抗病基因的克隆策略
• 1.1.3 植物抗病基因的结构
• 1.2 基因的图位克隆
• 1.2.1 分子标记技术研究进展
• 1.2.2 大片段基因组文库载体研究进展
• 1.2.3 农杆菌介导的遗传转化及功能验证
• 1.3 水稻基因组研究及其生物信息学分析研究现状
• 1.3.1 水稻遗传图谱和物理图谱的构建
• 1.3.2 水稻基因组测序
• 1.3.3 生物信息学的应用
• 1.4 水稻白叶枯病及其抗病基因研究进展
• 1.4.1 水稻白叶枯病概况
• 1.4.2 水稻白叶枯病抗性基因的鉴定与分子定位
• 1.4.3 抗水稻白叶枯病新基因Xa23的鉴定和分子标记定位
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 Xa23基因的RFLP标记定位及其STS标记的转化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 水稻材料
• 2.2.2 抗白叶枯病鉴定
• 2.2.3 基因组DNA的提取
• 2.2.4 杂交探针制备
• 2.2.5 RFLP分析
• 2.2.6 遗传作图
• 2.2.7 STS-PCR分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 探针插入片段检测
• 2.3.2 亲本间RFLP多态性分析
• 2代群体RFLP分析及Xa23遗传定位'>2.3.3 F₂代群体RFLP分析及Xa23遗传定位
• 2.3.4 RFLP标记C1003A转化为STS标记
• 2.4 讨论
• 第三章 CBB23基因组TAC文库的构建及筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 水稻材料
• 3.2.2 质粒载体
• 3.2.3 TAC文库构建方法
• 3.2.4 TAC文库的筛选
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 文库的构建
• 3.3.2 文库分析
• 3.3.3 文库筛选
• 3.4 讨论
• 第四章 Xa23基因的新标记开发与定位
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 水稻材料
• 4.2.2 抗白叶枯病鉴定
• 4.2.3 基因组DNA的提取
• 4.2.4 BLAST分析
• 4.2.5 以日本晴序列开发新标记
• 4.3 结果
• 4.3.1 Xa23基因对应位点的日本晴跨叠克隆群的建立
• 4.3.2 特异引物PCR扩增多态性分析及精细遗传图谱构建
• 2代群体接种鉴定'>4.3.3 IR24/CBB23 F₂代群体接种鉴定
• 4.3.5 用IR24/CBB23群体寻找新的分子标记
• 4.3.6 Xa23基因的精细遗传连锁图谱
• 2部分植株的F₃群体接种验证'>4.3.7 用IR24/CBB23 F₂部分植株的F₃群体接种验证
• 4.4 讨论
• 第五章 候选基因的功能验证
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 候选BAC克隆608生物信息学分析
• 5.2.2 植物遗传转化表达载体构建
• 5.2.3 RNAi载体构建
• 5.2.4 水稻遗传转化受体材料
• 5.2.5 水稻遗传转化方法
• 5.2.6 转基因植株的检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 BAC克隆608的ORF预测与分子标记的整合
• 5.3.2 比较基因组学分析与候选Xa23基因预测
• 5.3.3 候选基因植物表达载体的构建
• 5.3.4 候选基因植物表达载体pCAMBIA1300的筛选
• 5.3.5 RNAi载体的构建
• 5.3.6 水稻的组织培养和遗传转化
• 5.3.7 水稻遗传转化植株的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 亚克隆文库的构建
• 5.4.2 基因预测
• 5.4.3 遗传转化受体与培养条件
• 5.4.4 RNAi载体的构建
• 5.4.5 基因功能验证
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历