柑橘衰退病RNAi载体构建、遗传转化与转基因植株的评价

论文摘要

柑橘产业是我国南方农村的重要支柱产业,而每年由柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus, CTV）造成的经济损失巨大。柑橘衰退病病毒属于正义单链RNA病毒。由于利用RNAi技术进行抗植物RNA病毒已有大量成功的报道,所以应用RNAi原理进行抗CTV育种可能成为解决CTV防治的有效方法。RNA病毒侵染植物时,一般表达沉默抑制因子使宿主植物细胞中RNAi机制钝化从而达到成功侵染植物的目的。因此阻断病毒的沉默抑制因子的表达将有助于植物抵抗病毒的侵染,从而达到抗病毒的效果。本试验将CTV中三个沉默抑制因子p25、p20和p23作为RNAi靶标序列,目的是要获得对柑橘CTV有广谱抗性的柑橘品种。（1）RNAi载体的构建、转化和转基因植株的验证根据CTV基因组RNA中的沉默抑制因子p25、p20和p23的序列保守区域设计引物,经RT-PCR成功克隆相关基因片段。利用重叠延伸PCR拼接法（Gene Splicing by Overlap Extension, SOE）拼接PCR产物,获得两条多基因大片段P2520、P252023。为了便于克隆操作,在正向片段下游引物末端加上限制性内切酶BglⅡ识别序列；在巢式PCR上游引物末端加上KpnⅠ识别序列,下游引物加上BglⅡ识别序列,经TA克隆得到含两个沉默抑制因子pe5和p20基因片段的反向重复序列载体pTZ57R-HP2520。应用同样的方法得到含三个沉默抑制因子pe5,p20和p23基因片段的反向重复序列载体pTZ57R-HP252023。载体pTZ57R-HP2520与pCAMBIA-2301G经SacⅠ和BamHⅠ双酶切,胶回收目的片段后用T4-DNA连接酶连接两个片段,然后转入大肠杆菌DH5α中,提取质粒后用Sad和BamHⅠ双酶切检测目的片段。然后将此质粒转化入农杆菌LBA4404菌株。含有质粒pCAMBIA2301-HP2520的农杆菌被用来与锦橙上胚轴共培养获得转基因植株。本试验共获得了抗性不定芽20个,嫁接后再生成活7株,利用T-DNA区域内的GUS基因特异引物PCR检测6株为阳性,同时用NPTⅡ基因特异引物PCR检测7株为阳性。应用同样的方法获得RNAi双元质粒表达载体pCAMBIA2301-HP252023,农杆菌介导转化锦橙上胚轴后诱导获得抗性不定芽1个,嫁接再生成活1株,经特异引物检测发现GUS基因和NPTⅡ基因均为阳性。（2） pCAMBIA2301-HP20转基因酸橙植株的评价分两步对本实验室已经构建好的针对沉默抑制因子p20的单基因片段RNAi （pCAMBIA2301-HP20）转基因酸橙植株进行评价。首先,8株转基因植株经过GUS组织化学染色鉴定和针对p20基因的特异引物PCR检测,证实所有的转基因植株都成功的转入了目的片段。其次,将转基因植株嫁接备份后做攻毒试验,即对其中5株转基因植株嫁接接种CTV强毒系TRL514。分别在接毒30d、50d和60d后用RT-PCR检测CTV存在情况,结果发现对照植株和其中两个转基因植株中的检查结果呈阳性,其余三株转基因植株迄今为止没有检测出CTV病毒RNA。不过,这三株未检测到CTV的转基因植株还需要再次进行攻毒试验,因此,它们是否真正对CTV具有持续稳定的抗性还需要进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 柑橘及柑橘衰退病防治研究进展
• 1.1.1 柑橘
• 1.1.2 柑橘衰退病
• 1.1.3 柑橘衰退病的防治
• 1.1.4 抗柑橘衰退病育种研究进展
• 1.2 RNAi原理及其应用研究进展
• 1.2.1 miRNA作用机制
• 1.2.2 siRNA
• 1.2.3 piRNA作用机制
• 1.2.4 RNAi的特点
• 1.2.5 RNAi技术的应用研究
• 1.2.6 RNAi在植物抗病毒工程中的应用
• 1.2.7 RNA沉默抑制因子的研究进展
• 1.3 柑橘遗传转化再生系统研究进展
• 第二章 引言
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 主要技术路线图
• 第三章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 柑橘材料、质粒和CTV病毒
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 常规试验方法
• 3.2.2 克隆目标序列
• 3.2.3 多基因大片段构建策略
• 3.2.4 RNAi载体的构建策略
• 3.2.5 卡那霉素敏感性试验
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 转基因植株的再生
• 3.3 pCAMBIA2301G-HP20转基因植株的评价
• 3.3.1 GUS组织化学染色
• 3.3.2 PCR检测
• 3.3.3 CTV攻毒实验
• 第四章 结果与分析
• 4.1 引物设计结果
• 4.2 克隆目标序列
• 4.3 多基因大片段构建
• 4.3.1 P2520片段的拼接
• 4.3.2 P252023片段的拼接
• 4.4 RNAi载体pCAMBIA2301-HP2520的构建
• 4.4.1 中间载体pTZ57R-HP2520的构建
• 4.4.2 RNAi载体pCAMBIA2301-HP2520的构建
• 4.5 RNAi载体pCAMBIA2301-HP252023的构建
• 4.5.1 中间载体pTZ57R-HP252023的构建
• 4.5.2 RNAi载体pCAMBIA2301-HP252023的构建
• 4.6 锦橙上胚轴对卡那霉素的敏感性试验
• 4.7 转化与转基因植株的再生
• 4.8 pCAMBIA2301-HP20转基因植株的评价
• 4.8.1 GUS组织化学染色
• 4.8.2 PCR检测
• 4.8.3 CTV攻毒实验
• 第五章 讨论
• 5.1 CTV沉默抑制因子的拼接
• 5.2 RNAi表达载体的构建
• 5.3 柑橘遗传转化体系
• 5.4 转基因植株再生
• 5.5 转基因植株的评价
• 5.5.1 外源基因对转基因植株的影响
• 5.5.2 外源基因整合情况
• 5.5.3 CTV攻毒
• 5.6 利用RNAi防治CTV
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ缩略词表
• 致谢
• 在学期间所发表的文章
• 参研的项目