基于核酸内切酶及RNA连接酶的循环放大检测DNA及肿瘤细胞

论文摘要

针对恶性肿瘤等疾病早期检测方法灵敏度与准确性尚需提高的问题，研究基于核酸内切酶及RNA连接酶的循环放大反应，用于DNA片段和肿瘤细胞的检测。利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切原理及RNA连接酶的交叉催化自我复制性质，设计常温循环放大反应，实现信号放大，从而提高检测灵敏度。将核酸内切酶及RNA连接酶参与的循环放大与DNA和肿瘤细胞的检测相结合，提高了检测的灵敏度，同时降低了检测限，实现较低含量DNA片段及肿瘤细胞的高灵敏检测，为重大疾病的早期诊断提供检测手段。本论文共分为五章：第一章，概述了DNA的组成与分类、核酸内切酶的简介及作用并简单介绍了DNA逻辑门，化学发光分析与荧光化学分析等方法。对RNA连接酶的交叉复制与循环放大做了说明，对肿瘤细胞的检测及前景做了介绍。第二章，利用DNA能与其互补链杂交或者能特异性的与靶分子结合的特性，构建了多输入“AND”逻辑门，同时检测三种靶DNA片段。该逻辑门由G1/G2与I1、I2、I3杂交形成，其中G1自身两端分别杂交形成颈-环结构，中间部分与G2的两端互补使G2也形成凸起结构。当待测的I1、I2、I3存在时，分别与其互补的环状单链DNA（ssDNA）杂交，引发循环反应。对于在包金的纳米磁微粒表面修饰相应的DNA链P1，通过输入I1、I2、I3片段，将三环发卡状的G1/G2打开，使G1与金纳米磁珠上的发卡状DNA链P1互补，通过限制性剪切酶的作用，将互补的DNA部分剪断，形成两段hemin的适体，通过hemin与适体的特异性结合，催化luminol和H2O2化学发光，得到检测信号。检测三种DNA的线性范围为1.0×10-12M至5.0×10-11M，检测限为1.2×10-12M。第三章，通过DNA的碱基A与T，G与C互补原理，构建DNA“OR”逻辑门，并进一步利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切原理，将核酸内切酶参与的循环放大与DNA逻辑门相结合，提高DNA逻辑门的灵敏度。作为输入条件的三段DNA片段I1、I2、I3。当有任意一条DNA存在并且浓度均高于1.0×10-12M的条件下，通过DNA互补作用，产生dsDNA片段。而每一个互补的片段中设计了特定的限制酶剪切位点，在限制酶的存在下将会剪切成更小的片段，通过设计的模板与DNA聚合酶的作用，产生出便于检测的特定DNA序列3，3与带有荧光基团修饰的DNA链互补，通过剪切与磁分离，做荧光检测，而此过程在DNA内切酶与聚合酶等的作用下会不断循环，得出对于输入条件DNA的浓度在1.0×10-12M至5.0×10-11M范围内成良好的线性关系，其检测限为2.0×10-12M。第四章，研究了RNA连接酶参与的交叉循环信号放大对于肿瘤细胞的检测。利用表面修饰了羧基的磁微粒作为DNA的载体，与一端修饰了氨基的Ramos细胞适体S1形成化学键，将DNA链S1修饰到磁珠表面，并且通过碱基互补配对原理使S1与S2杂交成双链。当加入不同个数的Ramos细胞时，由于细胞的取代作用，在上清液里分离出不同条数的S2链。当有S2存在时，能与两条RNA链E1、E2形成杂交体，该杂交体具有RNA连接酶的作用，将RNA链A1、A2连接成链E0，生成的E0链与一端修饰了荧光基团一段修饰了淬灭基团的发卡DNA链S3形成互补，从而S3链被打开，荧光发光增强。检测Ramos细胞的检测限线性范围为50～1000cell/mL，检测限达67cell/mL，且具有良好的选择性。检测同时还利用化学发光分析进行对照检测，二者相关性较好，说明该方法具有良好的精确度。第五章，结论部分，对全文内容进行了总结。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 DNA 简介
• 1.1.1 DNA 的组成
• 1.1.2 DNA 的结构
• 1.1.3 DNA 的变性与复性
• 1.2 逻辑门
• 1.3 核酸内切酶
• 1.3.1 限制性内切酶简介
• 1.3.2 限制性内切酶作用
• 1.3.3 酶切分析应用
• 1.4 适体
• 1.4.1 适体简介
• 1.4.2 适体的特点
• 1.5 化学发光分析（CL）
• 1.5.1 化学分光分析的基本原理
• 1.5.2 化学发光分析的常见体系
• 1.6 荧光分析法（FL）
• 1.7 肿瘤细胞
• 1.7.1 细胞的基础知识
• 1.7.2 适体用于肿瘤细胞检测
• 1.8 电泳简介
• 1.8.1 概述
• 1.8.2 技术原理
• 1.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.9 RNA 连接酶
• 1.10 课题立项依据及研究内容
• 第二章 基于信号放大的 DNA 化学发光逻辑门的研究
• 摘要
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 巯基 DNA 的前处理与修饰
• 2.2.2.2 链 G1/G2 与输入信号 I1、I2、I3 链的杂交反应
• 2.2.2.3 化学发光检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 反应条件对化学发光的影响
• 2.3.3 不同进样方式对化学发光的影响
• 2.3.4 体系反应条件的优化
• 2.3.5 线性范围
• 2.3.6 各 I1、I2、I3 链存在不同情况下测信号
• 2.3.7 “与”门（AND）逻辑操作
• 2.4 小结
• 第三章 级联循环放大荧光 DNA“或”门的研究
• 摘要
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 磁珠的洗涤与 DNA 修饰
• 3.2.2.2 链 G1/G2 与 I1、I2、I3 的杂交
• 3.2.2.3 DNA 荧光检测
• 3.2.2.4 DNA 电泳表征
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 反应条件的优化
• 3.3.3 检测的线性范围
• 3.3.4 “或”门操作
• 3.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4 小结
• 第四章 利用 RNA 自身催化能力检测肿瘤细胞的研究
• 摘要
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 荧光实验方法
• 4.2.2.1 磁珠的洗涤与 DNA 修饰
• 4.2.2.2 细胞与适体结合取代 S2
• 4.2.2.3 加入荧光基团修饰的 S3
• 4.2.2.4 荧光检测
• 4.2.3 化学发光实验方法
• 4.2.3.1 磁珠的洗涤与 DNA 修饰
• 4.2.3.2 细胞与适体结合取代 S2
• 4.2.3.3 加入磁珠修饰了的 DNA S1’
• 4.2.3.4 化学发光检测
• 4.2.4 癌细胞的培养
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 反应条件对化学发光的影响
• 4.3.2.1 luminol 浓度的选择
• 2O₂浓度的选择'>4.3.2.2 H₂O₂浓度的选择
• 4.3.2.3 缓冲溶液 pH 值的选择
• 4.3.2.4 细胞与适体反应时间的选择
• 4.3.3 用荧光做 S2 的单独实验
• 4.3.4 用化学发光做 S2 单独实验
• 4.3.5 荧光法测细胞
• 4.3.6 化学发光法测细胞
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录：攻读硕士学位期间已发表和待发表的学术论文目录