Gluconobacter Suboxydans葡萄糖酸发酵关键基因的遗传操作

论文摘要

葡萄糖酸是葡萄糖经过氧化反应生成的温和有机酸,葡萄糖酸作为膨松剂、凝固剂、螯合剂、酸味剂而广泛应用于食品、化工、水处理、建筑等行业。生产葡萄糖酸的主要方法有：微生物发酵法、均相催化氧化法、电解氧气法和多相催化氧化法。微生物发酵法生产葡萄糖酸是当前国内外最有竞争力的生产方法。Gluconobacter suboxydans在周质空间上具有丰富的氧化酶类,可以氧化山梨醇、葡萄糖、甘油等,生成山梨糖、葡萄糖酸、二羟基丙酮等化工产品,是一类重要的工业菌。Gluconobacter suboxydans中转化葡萄糖生成葡萄糖酸的关键酶是PQQ（pyrroloquinolinequinone）依赖型的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase, EC1.1.1.5.2, GDH）。本论文以提高葡萄糖酸发酵产量为目标,对Gluconobacter suboxydansJ12（简称J12）发酵葡萄糖酸的生理特性进行了研究,在此基础上对J12的葡萄糖脱氢酶基因进行了基因克隆、基因敲除、基因两倍拷贝表达和影响其活性的其他酶基因的敲除等遗传操作,实验结果如下：1)研究了J12的生长特性,测定了此菌的生长曲线,确定了1%的山梨醇为最适碳源,最适pH值为6.0-6.5,最佳的培养时间为18 h。5L发酵罐实验结果表明,利用初始浓度100 g/L的葡萄糖,发酵8 h,摩尔转化率达到97.79%。2) 以J12基因组DNA为模板,基于PQQ附着位点的保守区域分析设计引物,获得了部分基因片段,并进一步通过TAIL-PCR获得编码GDH的全长基因（gdh）对其序列进行生物信息学分析：测序结果分析表明,gdh基因全长2 268 bp,编码755个氨基酸；其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的相对分子质量约为81.72 kD,pI约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的随意卷曲三种结构模块组成；GDH N末端的1-140AA区域含有5个跨膜结构域。3)构建了葡萄糖脱氢酶基因敲除的打靶片段,电转化到J12感受态细胞,获得四环素抗性菌株,分子鉴定为gdh-突变株。显色活性检测结果表明：gdh-菌株的葡萄糖脱氢催化活性减弱,说明gdh编码的PQQ依赖性的葡萄糖脱氢酶是催化葡萄糖脱氢转化成为葡萄糖酸的关键酶。4)为了减少周质空间其他氧化酶的竞争占位,提高葡萄糖脱氢酶的催化活性,构建了甘油脱氢酶基因（简称sldh）敲除的打靶片段,电转化到J12感受态细胞,获得庆大霉素抗性菌株,分子鉴定为sldh阳性突变株（简称sldh-菌株）。显色活性检测结果表明：sldh菌株没有甘油脱氢的催化活性,但葡萄糖脱氢酶催化能力并没有明显提高;两株菌葡萄糖发酵结果表明：发酵20 h,发酵液中残糖含量野生菌J12为10.02g/L,sldh菌株为10.53 g/L。显色结果和发酵结果都说明甘油脱氧酶基因的敲除,没有提高葡萄糖脱氢酶的催化效率,对葡萄糖发酵没有影响。5)构建了gdh双倍拷贝的打靶片段,电转化J12的感受态细胞,获得庆大霉素抗性菌株,分子鉴定为gdh+阳性突变株（简称gdh+菌株）。碳酸钙平板、显色法结果表明gdh+菌株与J12菌株没有明显差别：发酵实验结果表明,发酵20 h,发酵液中残糖含量gdh+菌株为9.8 g/L,野生菌J12为10.02 g/L。说明gdh基因的过量表达对葡萄糖酸发酵没有影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 本课题研究的背景及其意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 葡萄糖酸的简介
• 1.2.2 葡萄糖酸的应用及其市场
• 1.2.3 葡萄糖酸生产的的研究
• 1.2.4 醋酸葡萄糖酸杆菌的研究
• 1.2.5 葡萄糖脱氢酶的研究
• 1.3 本课题的研究内容
• 第2章 Gluconobacter suboxydans发酵生产葡萄糖酸的生理特性
• 2.1 实验仪器
• 2.2 主要试剂
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 生长曲线的测定
• 2.3.2 pH值测定
• 2.3.3 L-山梨糖的测定
• 2.3.4 残糖的测定
• 2.3.5 HPLC检测葡萄糖酸
• 2.4 培养基及其培养条件
• 2.4.1 活化培养基（g/L）
• 2.4.2 固体培养基（g/L）
• 2.4.3 种子培养基（g/L）
• 2.4.4 发酵培养基（g/L）
• 2.4.5 种子培养
• 2.4.6 摇瓶发酵培养
• 2.5 J12的形态特征
• 2.6 不同碳源对J12生长的影响
• 2.7 不同初始pH值对J12生长的影响
• 2.8 溶氧对J12生长的影响
• 2.9 J12生长曲线的测定
• 2.10 甘氨酸对J12生长的影响
• 2.11 碳酸钙对葡萄糖酸发酵过程的影响
• 2.12 5L发酵罐菌种能力验证实验
• 2.13 本章小结
• 第3章 利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans的葡萄糖脱氢酶基因及生物信息学分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 质粒与载体
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 各种试剂盒
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 J12基因组DNA的提取
• 3.2.2 编码GDH的基因（gdh）保守片段的克隆
• 3.2.3 Gdh基因全序列的克隆与分析
• 3.2.4 序列分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Gdh基因保守区中间片段的克隆
• 3.3.2 TAIL-PCR扩增N端和C端基因序列
• 3.3.3 Gdh全基因序列分析
• 3.4 本章小结
• 第4章 葡萄糖脱氢酶基因的敲除
• 4.1 材料和仪器
• 4.2 实验方法
• -打靶片段的构建'>4.2.1 Gdh^-打靶片段的构建
• -打靶片段的转化'>4.2.2 Gdh^-打靶片段的转化
• -菌株的筛选与分子鉴定'>4.2.3 Gdh^-菌株的筛选与分子鉴定
• -菌株的活性检测'>4.2.4 Gdh^-菌株的活性检测
• 4.3 结果与讨论
• -打靶片段的构建'>4.3.1 Gdh^-打靶片段的构建
• -菌株的筛选与分子鉴定'>4.3.2 Gdh^-菌株的筛选与分子鉴定
• -菌株的活性检测'>4.3.3 Gdh^-菌株的活性检测
• 4.4 本章小结
• 第5章 甘油脱氢酶的敲除
• 5.1 材料和仪器
• 5.2 实验方法
• -打靶片段的构建与转化'>5.2.1 Sldh^-打靶片段的构建与转化
• -菌株的筛选和分子鉴定'>5.2.2 Sldh^-菌株的筛选和分子鉴定
• -菌株产酸性能研究'>5.2.3 Sldh^-菌株产酸性能研究
• 5.3 结果与讨论
• -打靶片段的构建与转化'>5.3.1 Sldh^-打靶片段的构建与转化
• -菌株的筛选和验证'>5.3.2 Sldh^-菌株的筛选和验证
• -菌株的产酸性能研究'>5.3.3 Sldh^-菌株的产酸性能研究
• 5.4 本章小结
• 第6章 葡萄糖脱氢酶基因的双倍表达突变体构建
• 6.1 材料和仪器
• 6.2 实验方法
• +打靶片段的构建与转化'>6.2.1 Gdh⁺打靶片段的构建与转化
• +菌株的筛选和分子鉴定'>6.2.2 Gdh⁺菌株的筛选和分子鉴定
• +菌株的产酸性能研究'>6.2.3 Gdh⁺菌株的产酸性能研究
• 6.3 结果与讨论
• +打靶片段的构建与转化'>6.3.1 Gdh⁺打靶片段的构建与转化
• +菌株的筛选和验证'>6.3.2 Gdh⁺菌株的筛选和验证
• +菌株的产酸性能研究'>6.3.3 Gdh⁺菌株的产酸性能研究
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢