小麦根中盐胁迫响应基因FBPA的克隆及鉴定

论文摘要

盐分是影响植物生长和产量的主要环境因子之一。在分子水平上,盐胁迫可以使植物中一些基因的表达状况发生改变,促进或抑制某些蛋白质的合成,提高其耐盐性。克隆植物耐盐相关基因并利用转基因技术培育植物耐盐品种为抗盐育种的研究开辟了广阔的应用前景。但由于植物耐盐性是一个受多基因控制的复杂的数量性状,其耐盐机制十分复杂,因此,有必要利用基因组学的方法分离并深入研究一些盐胁迫应答基因,并对这些基因进行植物转基因研究,以期培育出耐盐的转基因植物,从而更好地指导农业生产。小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物。耐盐小麦品种山融3号（SR3）是小麦品种济南177（Triticum aestivum L.2n=42）与其近缘野生种长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum 2n=70）经过不对称体细胞杂交技术获得的体细胞杂种渐渗系。遗传及生理生化的分析表明,该品种含有长穗偃麦草染色体小片段,耐盐指数及各项生理生化指标均明显优于亲本小麦。山融3号不同于其它耐盐相关研究所利用的单一遗传背景的材料,其耐盐性由主效基因和微效基因共同控制。本实验室以山融3号小麦和济南177小麦为材料,利用抑制性差减杂交技术（suppressive subtractivehybridization,SSH）技术构建了山融3号和济南177盐胁迫响应的SSH cDNA文库。本研究根据小麦SSH cDNA文库中的相关信息,克隆得到一个在小麦根中对盐胁迫条件产生应答的果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因（TaFBPA）,并对其进行了初步鉴定和研究。果糖1,6-二磷酸醛缩酶是生物体内碳代谢及糖代谢途径中的关键酶之一,它催化果糖1,6-二磷酸分解为磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛及其逆反应。本研究利用嵌套PCR技术从小麦中克隆得到果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因的全长cDNA序列,将其命名为TaFBPA。生物信息学分析表明该基因属于果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因家族,该基因编码一个由358个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白与玉米、拟南芥、水稻中同源基因的蛋白的相似性分别为88.55%、82.12%、77.99%。RT-PCR及Real-Time PCR分析结果表明,较高浓度的短期盐胁迫条件下,该基因在小麦根中发生明显的上调表达。构建植物瞬时表达载体,将该基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起并转化拟南芥原生质体,结果表明,融合蛋白定位于细胞质中。构建原核表达载体,将该基因连入pZT32a载体并转化大肠杆菌菌株DE3进行原核表达,经IPTG诱导后,可以检测到目的蛋白大量表达,为下一步纯化融合蛋白并测定体外醛缩酶酶活性奠定基础。构建植物过量表达载体,利用农杆菌介导的花浸染方法转化拟南芥,获得转基因拟南芥后代。种子萌发实验表明,在盐胁迫条件下,与对照株系的种子相比,转基因株系的种子萌发延迟,且萌发率低,这表明过量表达TaFBPA基因的转基因拟南芥株系的种子对盐胁迫比较敏感。需要进一步的研究以期揭示TaFBPA基因参与植物盐胁迫应答的作用机理。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.盐胁迫对植物的影响
• 1.1 盐胁迫对植物种子萌发及植株生长发育的影响
• 1.2 对植物生理生化代谢的影响
• 2.盐胁迫对植物造成伤害的作用机理
• 2.1 渗透胁迫
• 2.2 离子胁迫
• 2.3 氧化胁迫及膜损伤
• 3.植物对盐胁迫的适应及耐盐机理
• 3.1 渗透平衡调节
• 3.2 离子平衡的重建
• 2+在盐胁迫中的作用'>3.3 Ca²⁺在盐胁迫中的作用
• 3.4 活性氧（ROS）在细胞内的清除机制
• 第二章 研究工作
• 引言
• 一.材料与方法
• 1 实验材料及试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 生物软件工具及数据库
• 1.5 培养基和常用溶液
• 2.实验方法
• 2.1 小麦根中果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因TaFBPA的克隆
• 2.2 基因表达分析（RT-PCR和Real-Time PCR）
• 2.3 基因组序列的扩增
• 2.4 亚细胞定位研究
• 2.5 原核表达
• 2.6 35S启动子植物表达载体的构建
• 2.7 农杆菌感受态的制备与转化
• 2.8 拟南芥的转化、筛选及转基因株系表型分析
• 二.结果与分析
• 1.小麦根中TaFBPA基因的cDNA全长克隆与序列分析
• 2.小麦TaFBPA基因表达分析
• 3.亚细胞定位研究
• 3.1 瞬时表达载体的构建
• 3.2 瞬时表达结果表明TaFBPA蛋白定位于细胞质
• 4.原核表达
• 4.1 原核表达载体的构建
• 4.2 pET32a/TaFBPA的原核表达
• 5.植物表达载体构建
• 6.拟南芥转化及表型分析
• 6.1 拟南芥转化及阳性株系筛选
• 6.2 转基因株系的种子萌发实验分析
• 三.讨论
• 1.果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBPA的亚细胞分布与功能的关系
• 2.果糖1,6-二磷酸醛缩酶FBPA基因与植物胁迫应答反应的相关性
• 工作总结及展望
• 参考文献（REFERENCES）
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表