中药蒲葵子有效部位化学成分及药材质量控制的研究

论文摘要

蒲葵子为棕榈科植物蒲葵Livistona chinensis R.Br.的干燥成熟果实。性味甘、淡、涩,平,具有软坚散结、收敛止血之功效,适用于癥瘕结气,崩漏,跌打损伤,眼底出血等症。现代研究表明,蒲葵子具有抗癌之功效,民间广泛用于治疗各种癌症,如食道癌、鼻咽癌、恶性葡萄胎、白血病、绒毛膜上皮癌、肺癌。但对蒲葵子有效部位药理研究及化学成分研究未见有公开的报道。为了进一步合理开发利用蒲葵子药材,寻找其有效成分,揭示其抗肿瘤作用物质基础,并为药材质量标准的制定提供科学依据,本课题以蒲葵子为研究对象,对其药效物质基础进行了系统研究。化学成分预试验结果表明蒲葵子中可能含有酚类、蒽醌类、香豆素、甾体三萜类、皂苷类、氨基酸类等成分。本课题针对蒲葵子的功效及临床应用,选择适宜的肿瘤细胞株对蒲葵子进行了体外抗肿瘤活性部位初步筛选。首先对蒲葵子进行部位分离,对其石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物,采用MTT法测定了它们各自对人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人卵巢癌细胞株SKOV3、人结肠癌细胞株HT-29、人膀胱癌细胞株T24等四种瘤株的生长抑制情况;采用ELISA法检测了它们各自对肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）水平的影响;以活性部位作用于VEGF诱导后的人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）,采用RT-PCR和Western blot方法分析内皮细胞Flk-1 mRNA和蛋白的表达变化。结果表明,蒲葵子乙酸乙酯提取物可选择性地抑制结肠癌细胞株HT-29和膀胱癌细胞株T24肿瘤细胞的生长,其抑制率可分别达74.66%和86.52%,并可显著降低各肿瘤细胞株分泌VEGF的水平。石油醚提取物对HT-29和T24生长也有一定的抑制作用,其最高抑制率分别为43.80%和38.67%,并可降低各肿瘤细胞分泌VEGF水平,但作用强度均不及乙酸乙酯部位。水和正丁醇提取物未表现抗肿瘤活性。对VEGF诱导内皮细胞表达Flk-1 mRNA和蛋白,乙酸乙酯提取物表现出明显的抑制作用。药理研究结果表明蒲葵子乙酸乙酯提取物有较好的抗肿瘤作用,是抗肿瘤作用的主要活性部位,石油醚提取物也显示一定的活性。对体外抗肿瘤试验筛选出的活性部位,采用柱色谱方法进一步进行系统的化学成分分离和纯化,运用熔点测定、UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR等方法进行结构鉴定。从蒲葵子乙酸乙酯部位分离得到10个化合物,鉴定了其中5个化合物,分别为:（-）表缅茄儿茶精（（-）-epiafzelechin,Ⅰ）、β-胡萝卜苷（daucosterol,Ⅱ）、β-谷甾醇（β-sitosterol,Ⅲ）、1,6,8-三羟基-3-甲基蒽醌（emodin,Ⅵ）、5,7,4’三羟基-3’,5’-二甲氧基黄酮（tricin,Ⅶ）,其中1,6,8-三羟基-3-甲基蒽醌为首次从该植物中分得。采用GC-MS分析鉴定蒲葵子的石油醚提取部位脂肪酸成分,鉴定出其中11个化合物,占总脂肪酸的94.54%,其中棕榈酸（37.10%）、亚油酸（27.90%）、油酸（20.96%）相对含量较高,不饱和脂肪酸相对含量达到52.28%,并含有ω-3多不饱和脂肪酸:α-亚麻酸、二十碳五烯酸。本课题首次对蒲葵子药材进行了质量控制的研究。建立了小麦黄素对照品的标准;采用高效液相色谱法测定了蒲葵子药材中小麦黄素的含量;并对蒲葵子药材进行了指纹图谱的研究,研究结果表明,该方法稳定、可靠、重现性好,10批药材得到的色谱指纹图谱共标定了31个共有峰,其共有峰的相对保留时间基本一致,不同产地批次蒲葵子药材化学组成相似,其相对比例较稳定。综上所述,本课题首次确定了蒲葵子的乙酸乙酯提取物是其体外抗肿瘤作用的主要活性部位,石油醚提取物也有一定的活性。从乙酸乙酯提取物中分离鉴定了5个化合物,从石油醚提取物中鉴定了11个化合物。同时对蒲葵子药材进行了指纹图谱研究。本课题为最终揭示蒲葵子抗肿瘤作用及其物质基础,建立药材质量的科学评价方法,实现药材可持续开发利用及抗肿瘤中药新药开发提供了科学依据。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 中药蒲葵子有效部位的筛选研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 结果与讨论
• 第二部分 中药蒲葵子有效部位化学成分的研究
• 1 蒲葵子化学成分预实验
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 样品质量检查
• 1.3 化学成分预实验方法
• 1.4 小结
• 2 蒲葵子各提取物化学成分比较研究
• 2.1 仪器与试药
• 2.2 色谱条件
• 2.3 小结
• 3 蒲葵子乙酸乙酯部位化学成分研究
• 3.1 材料、仪器与试剂
• 3.2 提取与分离
• 3.3 化合物的结构鉴定
• 3.4 小结
• 4 蒲葵子石油醚部位脂肪酸GC-MS分析
• 4.1 材料、仪器与试剂
• 4.2 方法
• 4.3 实验结果
• 5 结果与讨论
• 第三部分 中药蒲葵子药材质量控制的研究
• 1 小麦黄素对照品标准
• 2 蒲葵子药材中小麦黄素的含量测定
• 2.1 仪器与试药
• 2.2 色谱条件
• 2.3 含量测定
• 2.4 小结
• 3 蒲葵子药材指纹图谱的研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 供试品溶液的制备
• 3.3 对照品溶液的制备
• 3.4 空白试剂试验
• 3.5 检测方法
• 3.6 蒲葵子药材指纹图谱的建立
• 3.7 小结
• 4 结果与讨论
• 第四部分 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 文献综述
• 附图
• 致谢
• 附录Ⅰ 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果