刘嬿杨剑豪郑皆炜谢军华孙瑛杜可明（上海血液中心HLA高分辨实验室200051）
【摘要】HLA分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用。方法：使用ABI3730xlDNA测序仪，采用SBT单链直接测序法，对上海地区的960份自愿加入中华骨髓库的志愿者血液标本进行DNA测序，其中HLA-I类基因对第2，3和4外显子单链单向测序，II类基因对第2外显子单链单向测序，以得HLA高分辨分型结果；对部分呈现血清学表达不一致的模棱两可高分辨结果标本，通过SSO技术确认；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，通过SSP或对2，3，4以外的外显子单链检测作进一步确认。结果：960份中华骨髓库上海分库的样本进行HLA的PCR-SBT高分检测，用DNA单链测序法一次性获得高分辨结果为720例；对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，通过SSP技术或2，3，4以外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例；对于部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标本我们采用SSO技术最终确认了唯一的高分结果；此外，还检测到待确认新基因4例。完成了本次实验标本100％高分结果入库要求。结论：SBT单链测序技术为主，PCR-SSO，PCR-SSP联合为辅，是骨髓库开展HLA高分辨分型工作的有力工具。
【关键词】SBT单链测序技术PCR-SSOPCR-SSPHLA高分辨分型中华骨髓库上海分库
人类主要组织兼容性抗原分子对于T细胞免疫的专一性鉴别扮演极重要的角色[1]，在器官或骨髓的移植过程中，捐赠者及受赠者的人类主要组织兼容性抗原分子兼容程度对于移植结果有相当大的影响，因此双方的HLA分型鉴定是移植之前一个必要的步骤。每年，中华骨髓库都对每位志愿加入中国造血干细胞捐献者资料库的志愿者做采样及HLA分型工作，为了提高库容使用率，增大移植量，减少流失率，骨髓库对HLA分形结果的要求也愈来愈高。过去对HLA的检测主要采用血清学方式[2]，但由于HLA基因具有相当高的多态性，大多HLA抗原之间仅有极少数、甚至只有一个氨基酸的差异存在，因此以过去的血清学方式已经无法像DNA检测方式一样有效的进行HLA分型,PCRSBT,SSO,SSP等检测技术正逐渐取代成为HLA检测的主要手段。
1材料与方法
1.1标本来源上海地区的960份志愿者血液标本。
1.2血样采集和基因组DNA制备静脉抽取受检者全血（EDTA抗凝）5ml，用DNA提取试剂盒（美国TexasBioGene公司）提取基因组DNA,供PCR-SSO,PCR-SSP和DNA测序用，剩余血标本于-80℃冻存备用。
1.3DNA单链序列分析用PCR-SBT高分辨测序分型试剂(美国TexasBioGene公司,)。严格按试剂说明书操作,首先取基因组DNA加酶和Buffer进行DNA扩增,再用1.5～2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行确认;最后消化酶对扩增产物进行纯化，在ABI3730xlDNA测序仪上作序列检测。所获数据用ACCUTYPE分型软件处理生成HLA分型报告。
1.4PCR－SSP严格按试剂说明书操作,根据HLA核苷酸碱基序列的多态性设计出特异性引物，和DNA序列互补结合，经PCR反应产生相应条带，若组中存在与特异性引物互补结合的DNA序列，即样本为该SSP结合的HLA基因阳性。
1.5PCR－SSO技术（序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应）严格按试剂说明书操作,利用多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苷酸探针，与特定片段PCR扩增产物进行杂交，用荧光免疫检测系统检测，在短时间内鉴定DNA的多态性。
2结果
2.1采用DNA提取试剂盒提取DNA，DNA样本必须溶解于灭菌水或溶解液中，每份DNA的浓度调整至10-40ng/l，A260/A280比值介于1.65到1.8之间。
2.2960份中华骨髓库上海分库的样本进行高分检测，用DNA单链测序法一次性获得高分辨结果为720例，约占总检测标本量的75%；针对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，我们又通过SSP技术或2，3，4以外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例，约占总检测标本量的22%；针对部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标本，我们用SSO技术最终确认了唯一血清型，约占总检测标本量的2%；此外，还检测到待确认新基因4例。至此，除新基因外，我实验室完成了本次实验标本100％高分结果入库。
3讨论
HLA(HumanLeukocyteAntigen，HLA)是具有高度多态性的人类免疫遗传基因，位于人类第六号染色体短臂上的HLA基因具有相当高的多态性，在非血缘造血干细胞移植(UnrelatedHematopoieticStemCellTransplantation，UHSCT)中参与抗原递呈等移植免疫应答反应。UHSCT受到移植后移植物抗宿主病(GraftVersusHostDisease，GVHD)的局限，因此全球范围内采用高分辨，即4位数编码等位基因分型作为UHSCT前的供体选择的标准。随着HLA基因序列的的公布，大多HLA抗原之间仅有极少数、甚至只有一个氨基酸的差异存在，因此以过去的血清学方式已经无法像DNA检测方式一样有效的进行HLA分型区分，近年来，HLA分型技术得到迅猛发展，如结合PCR技术的HLA分型（PCR-SSCP,PCR-RELP,PCR-SSO和PCR-SSP）和基因芯片HLA分型方法，然而这些方法存在不同程度的局限（3－5），需联合运用而相互弥补，获取唯一高分分型结果。
中华骨髓库于2011年要求上海分库HLA高分辨分型结果录入率100%。我实验室对960份中华骨髓库上海分库的样本进行PCR-SBT高分检测，用DNA单链测序法一次性获得高分辨结果为720例，约占总检测标本量的75%；针对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本，我们又通过SSP技术或2，3，4以外的外显子单链检测做进一步确认，共计标本211例，约占总检测标本量的22%；对于部分呈现血清学表达不一致的21例模棱两可高分辨结果标本，我们采用SSO技术剔除了不相关的血清型，最终确认了唯一的高分结果，约占总检测标本量的2%；此外，还检测到待确认新基因4例。至此，除新基因外，我实验室完成了本次实验标本100％高分结果入库。
实验证明，DNA单链序列分析能有效提高了唯一高分结果的比例，是众多HLA测序分型技术中大通量一次出高分结果比例最高的技术。它通过对一对等位基因的预先分组，将DNA单链作为扩增模板，大大降低了双链测序的高模棱两可结果的比例。但是，HLA基因的高多态性决定了用测序分型最后仍会有一部分中分结果或模棱两可结果无法解决，仍需其他技术加以辅助。本实验通过PCR-SBT和SSP，SSO技术的进一步联合应用，很大程度的弥补了这一测序中遇到的问题。例如，本实验中用到的DRB1*1401/1454,1201/1206/1210/1217-SSP分型试剂就是用特异性序列引物对目的基因进行扩增；而SSO技术则是利用多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苷酸探针，与特定片段PCR扩增产物进行杂交，用荧光免疫检测系统检测，在短时间内鉴定DNA的多态性。此外，对于第2，3，4外显子序列一致的等位基因，可增测第1，5，6等外显子序列，最终确立结果的唯一性，如在外显子1处，可区分HLA－A*68:01与68:11N，HLA－A*74:01与74:02，HLA－B*27:05与27:13，HLA－B*81:01与81:02；在外显子5处，可区分HLA－A*23:01与23:07N，HLA－B*07:05与07:06，HLA－B*07:02与07:61等。
本次试验中，我们还发现了4个待确认的新等位基因，其DNA序列与当前数据库中已知序列存在差异，确认工作正在进行中，这对丰富HLA数据库资源具有重要意义。
参考文献
[1]CruseJMandLewisRE,1998,AtlasofImmunology.CRCPress:77-97
[2]Terasaki,P.I.,Bernoco,F.,Park,M.S.,Ozturk,G.,andIwaki,Y.MicrodroplettestingforHLA-A,-B,-Cand–Dantigens.AmericanJournalofClinicalPathology69:103-120,1978.
[3]BrayRA;HurleyCK;KamaniNRNationalmarrowdonorprogramHLAmatchingguidelinesforunrelatedadultdonorhematopoieticcelltransplants2008(9Suppl)
[4]王东梅;单小燕;王立君新等位基因HLA-B*9537的确认和序列分析2009(06)
[5]刘江;崔爽;王东梅新等位基因HLA-A*1127的确认和序列分析2009(08)