大豆皂甙的结构鉴定及其生物活性研究

论文摘要

大豆皂甙广泛存在于豆科植物中，大豆是皂甙的主要膳食来源。对于大豆皂甙的结构与分类以及生物活性研究已有不少文献报道，有关大豆皂甙降血脂、抗癌、调节免疫、抗氧化、抗诱变和抑制HIV病毒等方面的研究工作更是成为学术界研究的热点。但是关于大豆皂甙抗肿瘤、降血脂的作用机制研究却鲜见报道。本文以天门大豆为原料，利用HPLC-ESI／MS2对分离纯化得到的大豆皂甙进行结构鉴定，并采用生物学前沿技术激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪、RT-PCR等对大豆皂甙的生物活性，包括抗氧化、体内外抗肿瘤、降血脂的功能作用与机制进行了系统的探索。主要研究结果如下： 1 大豆皂甙的分离纯化与结构鉴定 脱脂大豆粉用80％乙醇溶液按1∶27（W／V）的料液比在60℃下浸提5h，连续提取三次后达到最佳效果，大豆皂甙的提取率为2.58％。大豆皂甙醇提液经浓缩、正丁醇萃取、乙酸乙酯沉淀和大孔树脂D101A柱层析等方法纯化得到了SS-Ⅰ、SS-Ⅱ和SS-Ⅲ三个组分，得率分别为0.107％、0.093％和0.047％。采用HPLC-ESI／MS2联用技术对这三个组分进行系统分析与鉴定，发现SS-Ⅲ中含有Ba、Bb、Bc、Bb’和Be五种皂甙，SS-Ⅱ中除了含有SS-Ⅲ中五种皂甙外还含有A2，与SS-Ⅲ比较，SS-Ⅰ中还富含A1、A4和A2三种皂甙。 2 大豆皂甙体外抗脂质过氧化研究 大豆皂甙在体外具有很强的抗脂质过氧化活性。在大鼠肝匀浆和肝线粒体中加入不同浓度的SS-Ⅰ和SS-Ⅱ，分别研究了它们对大鼠肝组织自发性、H2O2-Fe2+诱导肝组织损伤和肝线粒体生成MDA的影响。结果表明SS-Ⅰ和SS-Ⅱ均能抑制大鼠肝组织和肝线粒体脂质过氧化物的生成，对H2O2-Fe2+诱导的肝组织过氧化损伤具有保护功效。在同样的浓度范围内，SS-Ⅰ抑制脂质过氧化作用的能力强于SS-Ⅱ，这可能与其组成及分子结构有关。 3 大豆皂甙对人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究 首次提出大豆皂甙诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡是其抗肿瘤活性的主要机制，细胞周期改变、线粒体跨膜电位下降、细胞胞浆内Ca2+浓度升高以及NO含量增加可能是细胞凋亡的作用机理之一。MTT实验发现100-400mg／L的SS-Ⅱ对Hela细胞的生长有显著的抑制作用，且具有时间-效应和剂量-效应关系，并且对小鼠成纤维细胞L929生长的影响较小。采用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜和激光扫描共

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 1 大豆皂甙的研究概况
• 1.1 大豆皂甙的化学研究
• 1.1.1 大豆皂甙结构
• 1.1.2 大豆皂甙的提取
• 1.1.3 大豆皂甙定性和定量分析
• 1.2 大豆皂甙的生理功能
• 1.2.1 抗肿瘤作用
• 1.2.2 免疫调节作用
• 1.2.3 降血脂作用
• 1.2.4 抗氧化作用
• 1.2.5 降血糖作用
• 1.2.6 抗病毒作用
• 1.2.7 保肝作用
• 1.2.8 其它生物功能
• 1.2.9 大豆皂甙的毒性
• 1.3 大豆皂甙的应用及开发前景
• 2 研究目的与研究内容
• 第一章 大豆皂甙的分离纯化与结构鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 大豆皂甙的分离纯化技术路线
• 1.2.2 大豆皂甙的测定方法
• 1.2.3 大豆异黄酮的测定方法
• 1.2.4 D101A大孔树脂的预处理与装柱
• 1.2.5 树脂的再生
• 1.2.6 薄层色谱分析
• 2检测'>1.2.7 大豆皂甙的HPLC-ESI／MS²检测
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆皂甙的提取分离条件确定
• 2.2 D101A大孔树脂柱层析纯化大豆皂甙
• -／MS²分析'>2.3 SS-Ⅲ的HPLC-ESI^-／MS²分析
• 2.3.1 SS-Ⅲ的高效液相色谱分离
• 2.3.2 电离方式的确定
• 2.3.3 质谱分析结果
• 2分析'>2.4 SS-Ⅱ的HPLC-ESI／MS²分析
• 2.4.1 SS-Ⅱ的高效液相色谱分离
• 2.4.2 电离方式的确定
• 2.4.3 质谱分析结果
• 2裂解规律探讨'>2.4.4 大豆皂甙的ESI／MS²裂解规律探讨
• 2分析'>2.5 SS-Ⅰ的HPLC-ESI／MS²分析
• 2.5.1 SS-Ⅰ的高效液相色谱分离
• 2.5.2 SS-Ⅰ的质谱分析结果
• 2.5.3 A1、A4大豆皂甙的碎裂机理
• 3 讨论
• 第二章 大豆皂甙抗脂质过氧化作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 大豆皂甙对大鼠肝组织匀浆脂质过氧化的影响
• 1.2.2 大豆皂甙对大鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
• 1.2.3 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆皂甙对大鼠肝匀浆自发性生成MDA的影响
• 2+-H₂O₂诱导大鼠肝匀浆生成MDA的影响'>2.2 大豆皂甙对Fe²⁺-H₂O₂诱导大鼠肝匀浆生成MDA的影响
• 2.3 大豆皂甙对大鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
• 3 讨论
• 第三章 大豆皂甙对人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 药品及培养液的配制
• 1.2.2 细胞计数实验
• 1.2.3 MTT法检测SS-Ⅱ对Hela细胞的生长抑制
• 1.2.4 Hela细胞形态学观察
• 1.2.5 原位（缺口）末端标记法（TUNEL）检测Hela细胞凋亡
• 1.2.6 流式细胞仪（FCM）检测SS-Ⅱ对Hela细胞周期的影响
• 1.2.7 FCM检测SS-Ⅱ对Hela细胞线粒体跨膜电位的影响
• 1.2.8 CLSM检测SS-Ⅱ对Hela细胞细胞浆钙离子浓度的影响
• 1.2.9 Hela细胞膜唾液酸的测定
• 1.2.10 Hela细胞中NO、NOS和iNOS的测定
• 1.2.11 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 SS-Ⅱ对Hela细胞的抑制作用
• 2.2 Hela细胞的形态学观察
• 2.2.1 可见光观察Hela细胞的形态学变化
• 2.2.2 荧光显微镜观察Hela细胞的形态学变化
• 2.2.3 激光扫描共聚焦显微镜观察Hela细胞的形态学变化
• 2.2.4 透射电镜观察Hela细胞的形态学变化
• 2.3 TUNEL检测SS-Ⅱ对Hela细胞的凋亡作用
• 2.4 FCM检测SS-Ⅱ对Hela细胞周期的影响
• 2.5 FCM检测SS-Ⅱ对Hela细胞线粒体跨膜电位的影响
• 2.6 CLSM检测SS-Ⅱ对Hela细胞细胞浆钙离子浓度的影响
• 2.7 SS-Ⅱ对Hela细胞膜中唾液酸的影响
• 2.8 SS-Ⅱ对Hela细胞中NO、NOS和iNOS的影响
• 3 讨论
• 22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究'>第四章 大豆皂甙对H₂₂荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验动物及细胞株
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 22瘤细胞悬液的制备'>1.2.1 H₂₂瘤细胞悬液的制备
• 1.2.2 动物分组
• 22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用'>1.2.3 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用
• 22荷瘤小鼠迟发型超敏反应的影响'>1.2.4 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠迟发型超敏反应的影响
• 22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响'>1.2.5 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
• 22荷瘤小鼠NK细胞活性的影响'>1.2.6 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
• 22荷瘤小鼠肝组织中MDA和SOD的测定'>1.2.7 H₂₂荷瘤小鼠肝组织中MDA和SOD的测定
• 22荷瘤小鼠肿瘤组织切片病理学观察'>1.2.8 H₂₂荷瘤小鼠肿瘤组织切片病理学观察
• 1.2.9 统计分析
• 2 结果与分析
• 22荷瘤小鼠体重的影响'>2.1 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠体重的影响
• 22荷瘤小鼠瘤重的影响'>2.2 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠瘤重的影响
• 22荷瘤小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响'>2.3 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响
• 22荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响'>2.4 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响
• 22荷瘤小鼠NK细胞活性的影响'>2.5 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
• 22荷瘤小鼠肝组织中MDA和SOD的影响'>2.6 SS-Ⅱ对H₂₂荷瘤小鼠肝组织中MDA和SOD的影响
• 2.7 肿瘤组织病理学观察
• 3 讨论
• 第五章 大豆皂甙预防小鼠高脂血症的作用及其分子机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 饲料
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 动物分组和饲养
• 1.2.2 大豆皂甙对小鼠脏器指数的影响
• 1.2.3 大豆皂甙对小鼠血脂的影响
• 1.2.4 大豆皂甙对肝脏中TC、TG、MDA、SOD和LPL的影响
• 1.2.5 大豆皂甙对小鼠LPL mRNA表达的影响
• 1.2.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆皂甙对小鼠体重的影响
• 2.2 大豆皂甙对小鼠脏器指数的影响
• 2.3 大豆皂甙对小鼠血脂的影响
• 2.3.1 大豆皂甙对小鼠血清TC和TG的影响
• 2.3.2 大豆皂甙对小鼠血清HDL-C、HDL-C／TC及LDL-C的影响
• 2.3.3 大豆皂甙对小鼠血脂水平的影响
• 2.4 大豆皂甙对小鼠肝脏组织中TC和TG的影响
• 2.5 大豆皂甙对小鼠肝脏组织中MDA和SOD的影响
• 2.6 大豆皂甙对小鼠肝脏组织中LPL含量的影响
• 2.7 大豆皂甙对小鼠肝脏和脾脏组织中LPL mRNA表达水平的影响
• 3 讨论
• 第六章 结论
• 第七章 综述：恶性肿瘤的细胞凋亡疗法
• 1 肿瘤的发生机制
• 1.1 肿瘤的概念
• 1.2 肿瘤的发生机制
• 2 肿瘤的传统治疗法
• 3 肿瘤的诱导凋亡疗法
• 3.1 中药诱导肿瘤细胞凋亡疗法
• 3.2 肿瘤的热疗法
• 3.3 基因治疗
• 3.3.1 bcl-2家族
• 3.3.2 p53
• 3.3.3 bcr／abl
• 3.3.4 Fas-FasL
• 3.3.5 细胞因子
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 图表目录（按先后顺序排列）
• 附录二 研究生期间发表的论文