论文摘要
研究背景和目的：肝纤维化是慢性肝脏疾病发展为肝硬化甚至肝癌的渐进性病理过程，是肝脏在多种损伤因素作用下发生的慢性代偿性修复反应。肝纤维化的发生机制比较复杂，涉及到细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，并且有多种细胞因子参与。因此，肝纤维化的分子生物学机制一直是研究的热点内容之一。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一种多功能的分泌性多肽，可以调节细胞增殖、分化以及黏附等生物学活性，在组织损伤修复、细胞外基质合成等方面发挥重要作用。研究证实，CTGF在肝纤维化中发挥促进纤维化发生发展的正调节作用。整合素是存在于肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）等细胞表面的受体蛋白，近年研究发现CTGF可以通过与整合素受体结合调节细胞内信号通路的活性。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是整合素信号通路中重要的细胞因子，激活后可以进一步启动下游一系列细胞信号级联反应。目前，CTGF促进肝纤维化的分子生物学机制还未完全明了，CTGF/整合素/FAK信号通路与肝纤维化的关系也尚无明确报道。传统中药在慢性肝脏疾病治疗中取得了一定的疗效，复方中药肝复康在治疗肝纤维化等慢性肝脏疾病中能够发挥有效成分丰富、生物学靶点多样等优点。本课题组已有研究发现肝复康能够明显改善肝功能、抑制炎症反应和延缓纤维化的进展过程。然而肝纤维化的发生机制中有多种细胞因子以及多条细胞信号通路参与，因此，肝复康的治疗肝纤维化的分子机制仍需完善。本研究的目的在于：第一，观察CTGF/整合素/FAK信号通路中CTGF、整合素α5β1、纤连蛋白（fibronectin，FN）、FAK、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB或Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6kinase，P70S6K）等关键蛋白分子在肝纤维化中的表达变化，探讨CTGF/整合素/FAK通路在肝纤维化中的作用；第二，观察肝复康对CTGF/整合素/FAK信号通路在肝纤维化中表达的影响，进一步研究肝复康治疗肝纤维化的分子生物学机制。方法：采用皮下注射CCl4法复制肝纤维化动物模型：将50只SD大鼠随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、肝复康大、中、小剂量治疗组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠皮下注射以橄榄油稀释的10%CCl4（5ml/kg），每周2次，正常对照组只注射同等体积的橄榄油；在肝复康大、中、小剂量治疗组，从注射CC14后第9周开始，分别每天给予肝复康（3125mg/kg、312.5mg/kg和31.25mg/kg）灌胃，至第20周结束。乙醛刺激法激活体外培养的HSCs：将传代培养的HSCs随机分为三组，分别为正常对照组：在含10％正常对照组血清的DMEM细胞培养基上常规培养；模型组（乙醛刺激）：在含10％正常对照组血清的DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L）；肝复康治疗组（乙醛刺激+肝复康含药血清）：在含10%的肝复康药物血清DMEM细胞培养基中加入乙醛（终浓度200μmol/L）。应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组织化学（IHC）以及免疫蛋白印迹（Western-blot）方法，检测各组大鼠肝组织中以及各组HSCs中CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路中关键细胞因子的表达情况。结果：1. CTGF、纤连蛋白和整合素α5β1在肝纤维化中的表达及肝复康的干预作用RT-PCR、Western-blot和免疫组化法观察大鼠肝组织中CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的表达情况，结果显示，与正常对照组相比，肝纤维化模型组中各指标的表达在mRNA水平和蛋白水平均有明显提高（P﹤0.01）；而在肝复康治疗组中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的表达量比模型组明显下降（P﹤0.01）。体外培养的HSCs中，乙醛刺激激活的HSCs模型组中，CTGF、整合素α5、整合素β1以及纤连蛋白的mRNA表达水平比正常对照组明显升高（P﹤0.01）；而经过肝复康含药血清作用后，与模型组相比，各指标的基因表达量明显下降（P﹤0.01）。2. FAK/Akt信号通路在肝纤维化中的作用以及肝复康的调节与正常对照组相比，肝纤维化模型组大鼠肝组织P-FAK和P-Akt的表达显著增多（P﹤0.01）；肝复康治疗组中二者的磷酸化程度与模型组相比，有明显下降（P﹤0.01）。RT-PCR结果显示，模型组的大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin, α-SMA）mRNA表达水平与正常对照组相比明显增高（P﹤0.01）；肝复康治疗后大鼠肝组织α-SMA mRNA表达量较模型组明显减少（P﹤0.01）。正常对照组HSCs表达少量的FAK，Akt以及α-SMA mRNA；模型组HSCs上述基因表达水平比正常对照组明显升高（P＜0.01）；肝复康含药血清治疗组HSCs表达FAK，Akt以及α-SMA mRNA水平比模型组明显下降（P﹤0.01）。3. mTOR/P70S6K信号通路与肝纤维化的关系以及肝复康的抑制作用mTOR、P70S6K、I型胶原和III型胶原mRNA在正常对照组中表达量很少；而在模型组中，以上指标的表达水平明显上调，比正常对照组明显增多（P﹤0.01）；在肝复康治疗组中，肝复康明显下调了各指标的mRNA表达水平，与模型组相比，明显降低（P﹤0.01）。与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织cyclinD1mRNA和蛋白的表达水平均有明显升高（P﹤0.01）；而肝复康治疗后，二者合成量较模型组明显减少（P﹤0.01）。正常对照组HSCs中，mTOR、 P70S6K、cyclinD1、I型胶原和III型胶原mRNA表达量极少；而乙醛刺激的HSCs模型组中，以上细胞因子的基因表达量比正常对照组明显增多（P﹤0.01）；肝复康含药血清作用后的HSCs与模型组相比，上述指标的表达水平显著下降（P﹤0.01）。结论：1. CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的激活促进了实验性大鼠肝纤维化的发生发展。2.体外培养HSCs的激活、增殖与CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的活化有关。3.肝复康通过抑制CTGF/整合素α5β1/FAK信号转导系统的表达和激活，在体内和体外实验两方面，干预肝纤维化的进展，从而起到治疗肝纤维化的作用。