论文题目: 腺伴随病毒介导的脑源性神经营养因子和神经营养素4对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞转染的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 眼科学
作者: 李海燕
导师: 赵家良
关键词: 视网膜神经节细胞,细胞培养,体外,重组腺伴随病毒载体,绿色荧光蛋白,转染,细胞毒性,脑源性生长因子,神经营养素,逆转录聚合酶链反应,酶联免疫吸附试验,凋亡
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的： 1．建立大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的体外培养方法。 2．研究重组腺伴随病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因(rAAV-GFP)对体外培养的大鼠RGCs的转染效率和毒性。 3．探讨应用重组腺伴随病毒载体介导的脑源性生长因子基因(rAAV-BDNF)和神经营养素4基因(rAAV-NT4)能否对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)进行转染，检测外源性BDNF基因和NT4在细胞内转录水平和翻译水平的表达。 4．判断rAAV-BDNF和rAAV-NT4转染后对RGCs生长活性和凋亡的影响。 方法： 1．取出生24小时内的S-D乳鼠的视网膜神经上皮层，胰酶消化，应用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养器皿预先用0.1mg／mL多聚赖氨酸(PLL)包被，培养24小时后，加入5-溴-2’-脱氧尿苷(20μg／mL)。培养过程中坚持不换液。 2．应用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体和PE-Thy1.1抗体进行鉴定，同时应用流式细胞学方法检测PE-Thy1.1抗体标记阳性细胞的比例。 3．细胞培养2d后，按转染倍数(MOI)为10~1～10~5转染RGCs；5d后行流式细胞仪检测不同MOI的rAAV-GFP对混合培养的RGCs的转染效率。应用MTT比色方法检测并比较各组细胞的生长活性。 4．分别应用rAAV-BDNF和rAAV-NT4转染培养2天的RGCs，MOI=10~5，继续培养7天。应用RT-PCR技术检测BDNF和NT4基因在细胞中mRNA水平的表达。 5．分别在rAAV-BDNF和rAAV-NT4转染7天和14天后收集细胞培养液，应用ELISA方法对每组培养液中的BDNF含量进行检测。 6．分别在rAAV-BDNF或rAAV-NT4转染后3、6和9天时，对转染细胞、未转染细胞进行MTT比色分析，比较不同组的细胞生长活性。 7．转染7天后，应用Annexin V-FITC凋亡试剂盒和流式细胞仪，检测rAAV-BDNF
论文目录:
缩略词表
中文摘要
英文摘要
总前言
总前言参考文献
第一部分：大鼠视网膜神经节细胞的体外培养
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第二部分：AAV介导GFP对体外培养的大鼠RGCs的转染
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第三部分：AAV介导的BDNF对体外培养的大鼠RGCs的转染
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第四部分：AAV介导的NT4对体外培养的大鼠RGCs的转染
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
结论
综述
综述一：视网膜神经节细胞体外培养的研究进展
综述二：眼科基因治疗的研究进展
综述三：腺伴随病毒载体在眼科中的应用
附录：我的协和五年(代致谢和个人简历)
声明
发布时间: 2006-10-13
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