抗菌肽在动物乳腺中的表达及对乳房炎主要病原菌的抑制效应研究

论文摘要

抗菌肽作为一种新型的抗微生物制剂,除了具有广谱抗菌活性外,还有消炎、免疫调节等多种生物学功能,通过乳腺表达抗菌肽预防奶牛乳房炎不仅具有理论意义而且具有广阔的应用前景。本研究通过重叠延伸PCR法合成了天蚕素B、天蚕素A-蛙皮素杂合肽、牛乳铁蛋白肽和牛气管抗菌肽四个全长的抗菌肽基因;利用山羊β-酪蛋白调控序列和真核基因表达质粒构建了乳腺特异性表达载体,乳腺表达检测结果显示,表达载体能够指导抗菌肽在乳腺中的瞬时表达,表达的重组蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有明显的抑制作用。为了达到利用抗菌肽长期有效预防乳房炎的目的,进一步构建了上述不同抗菌肽基因的重组逆转录病毒载体,并通过转染包装细胞获得了整合有抗菌肽基因的重组逆转录病毒,该病毒悬液注射妊娠期奶牛乳腺组织后,实现了抗菌肽在产犊后奶牛乳腺中稳定地通过乳汁分泌表达,并证明了其对临床分离的乳房炎主要病原菌具有明显的抗菌活性。本研究为通过乳腺表达抗菌肽预防奶牛乳房炎奠定了基础。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 奶牛乳房炎研究进展
• 第二章 抗菌肽的研究进展及其应用前景
• 第三章 基因治疗中的逆转录病毒载体
• 第二篇 研究内容
• 第一章 牛乳铁蛋白肽、天蚕素 A-蛙皮素杂合肽、天蚕素B 和牛气管抗菌肽基因的设计、拼接和克隆
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 天蚕素B 基因的合成与序列测定
• 2.2 牛气管抗菌肽基因的合成与序列测定
• 2.3 天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的合成与序列测定
• 2.4 牛乳铁蛋白肽基因的合成与序列测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 抗菌肽乳腺特异性表达载体的构建及其在动物乳腺中的瞬时表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 不同抗菌肽乳腺特异性表达载体的构建与鉴定
• 2.2 不同抗菌肽基因在山羊乳腺中的表达与活性检测
• 2.3 羊奶中表达产物抑菌活性比较
• 2.4 部分抗菌肽基因在奶牛乳腺中的表达与活性检测
• 2.5 抗菌肽在羊奶和牛奶中抑菌活性比较
• 2.6 表达产物的Tricine-SDS-PAGE 电泳检测
• 2.7 部分表达产物的RP-HPLC检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 抗菌肽逆转录病毒载体的构建、重组逆转录病毒的包装及其在奶牛乳腺中的稳定表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 逆转录病毒载体pLN-bCP-LfcinB-CE-MA（R）的构建与鉴定
• 2.2 逆转录病毒载体pLN-bCP-cecB-bTAP（R）的构建与鉴定
• 2.3 G418 对PA317 细胞最小致死剂量的测定
• 2.4 转染重组质粒阳性的PA317 细胞克隆的形成
• 2.5 PCR 检测细胞克隆株基因组中重组载体的整合
• 2.6 重组病毒感染滴度测定
• 2.7 重组病毒感染奶牛乳腺后表达产物抑菌活性检测结果
• 2.8 重组病毒感染奶牛乳腺后表达产物的Tricine-SDS-PAGE 检测结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 临床型乳房炎主要病原菌的分离、鉴定及重组抗菌肽对其抑菌活性观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 细菌分离鉴定结果
• 2.2 病原菌的敏感性
• 2.3 重组抗菌肽对乳房炎主要病原菌的抑菌试验
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的主要论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师及作者简介
• CURRICULUM VITAE