水稻ω-6脂肪酸去饱和酶基因克隆与功能研究

论文摘要

水稻是我国最主要的粮食作物之一,主要起源于热带和亚热带地区,其地理分布主要受温度的影响。不饱和脂肪酸是植物膜系统的重要组份之一,它在低温条件下维持细胞功能和保护植物体方面起到重要的作用。因此,采用遗传工程方法增加不饱和脂肪酸含量对培育水稻耐低温育种的研究意义重大,刻不容缓。本论文中采用RT-PCR的方法从水稻Oryza sativa L叶片中克隆到编码水稻内质网ω-6脂肪酸去饱和酶基因的开放阅读框（ORF）,全长1167bp,包含388个氨基酸,命名为OsFAD2（登录号No. FJ768953）。BLAST检索显示它与其它物种内质网ω-6脂肪酸去饱和酶基因（FAD2）具有较高同源性,氨基酸序列比对发现其包含膜结合蛋白所特有的三个保守的组氨酸簇,在C末端存在着内质网定位所必须的（-YNNKL）序列导肽,聚类分析显示该基因属于组成型表达FAD2基因。水稻OsFAD2为组成型表达基因,该基因在叶片中的表达量明显高于其它器官。原位检测结果表明：在根中,在黑暗和冷胁迫条件下,OsFAD2的表达与对照相比在各个组织中分布无明显变化;在叶中,黑暗处理条件下,OsFAD2在叶肉细胞和维管束组织中的表达量有所下调,而冷胁迫条件下OsFAD2的mRNA主要在表皮细胞中积累。Real-time PCR结果显示：受到在不同激素处理之后,OsFAD2基因的表达量上升。构建酵母真核表达载体PYES NT（C）-OsFAD2,经醋酸锉法转化酿酒酵母INVScl,通过缺尿嘧啶培养基筛选获得多拷贝阳性克隆菌株。Western blot结果表明同源重组的酵母能正常表达含有目的基因的融合蛋白,同源重组酵母在4℃低温下的菌落生长状况明显好于空载转化酵母,表明OsFAD2基因的转入提高了酵母对低温的耐受性。构建蛙卵表达载体pT7TS-OsFAD2,采用显微注射的方法转入蛙卵细胞中,外源施加油酸2h之后,可以监测到亚油酸的生成。构建重组植物表达载体pC AMBIA 1304-OsFAD2,通过农杆菌介导将OsFAD2基因转入拟南芥fad2突变体中,经潮霉素筛选获得T3代转基因种子。RT-PCR结果显示水稻FAD2基因能够互补拟南芥fad2突变体表型；同时,将OsFAD2基因导入到籼稻kasalath中,经过潮霉素筛选获得T2代转基因种子,我们检测了低温条件下的水稻发芽率、电导率和Fv/Fm,发现转基因株系与野生型相比,能够显著的耐受低温胁迫。更为重要的是,过表达OsFAD2基因的水稻株系,在生殖生长期能够表现出显著的耐寒性,低温处理之后,产量比对照组高46%。说明OsFAD2在低温条件下行使去饱和酶的功能,提高了细胞膜的流动性,从而提高了转基因水稻对低温的抗性。上述研究结果表明,在低温胁迫条件下,水稻OsFAD2基因过表达导致其宿主体内亚油酸含量的积累,改善了细胞膜的流动性,从而提高了宿主对低温耐受能力,证明OsFAD2基因在水稻耐寒育种方面有着广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 植物脂肪酸云饱和酶研究进展及水稻抗冷育种研究现状
• 1 植物脂肪酸的生理功能
• 1.1 植物脂肪酸与植物抗寒性
• 1.2 植物脂肪酸与植物抗高温性
• 1.3 植物脂肪酸与其他非生物胁迫
• 1.4 植物肪酸与植物抗病性
• 1.5 植物脂肪酸的食用及工业价值
• 2 植物脂肪酸去饱和酶研究进展
• 2.1 植物脂肪酸去饱和酶分类
• 2.2 植物脂肪酸去饱和酶基因的拷贝数
• 2.3 植物脂肪酸去饱和酶基因的结构
• 2.4 植物脂肪酸去饱和酶的序列分析
• 2.5 植物脂肪酸去饱和酶的活性调控
• 3 植物脂肪酸去饱和酶基因在遗传工程方面的应用
• 3.1 植物脂肪酸去饱和酶基因在品质改良方面的应用
• 3.2 植物脂肪酸去饱和酶基因在抗性改良方面的应用
• 3.3 植物脂肪酸去饱和酶基因其他的分子生物学作用
• 4 水稻中ω-3和ω-6脂肪酸去饱和酶的研究现状
• 参考文献
• 技术路线
• 第二章 水稻OsFAD2基因克隆与功能研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 水稻ω-6脂肪酸去饱和酶基因OsFAD2的克隆
• 2.2 RT-PCR
• 2.2.1 水稻OsFAD2基因器官表达模式
• 2.2.2 水稻OsFAD2基因激素诱导表达模式
• 2.3 GC测定激素处理后水稻叶片脂肪酸含量
• 2.4 原位杂交
• 2.5 OsFAD2基因在酿酒酵母中的表达
• 2.6 OsFAD2基因在蛙卵细胞中的表达
• 2.7 转基因拟南芥互补实验
• 2.8 转基因水稻综合评价
• 3 结果与讨论
• 3.1 OsFAD2基因克隆与序列分析
• 3.2 水稻OsFAD2基因诱导表达模式
• 3.3 原位杂交
• 3.4 OsFAD2基因在蛙卵细胞中的表达
• 3.5 OsFAD2基因在酿酒酵母中的表达
• 3.6 OsFAD2基因在拟南芥fad2中的表达
• 3.7 转基因水稻的综合性状的评价分析
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD2、OsFAD3、OsFAD8的克隆
• 2.2 农杆菌感受态的制备、转化和转化子鉴定
• 2.3 农杆菌介导水稻转基因
• 2.4 转基因水稻阳性植株筛选
• 3 结果与讨论
• 3.1 OsFAD2、OsFAD3和OsFAD8基因的克隆
• 3.2 Atcor15a基因启动子的克隆
• 3.3 重组载体构建结果
• 3.4 重组载体转化农杆菌阳性检测
• 0代转基因阳性植株的检测'>3.5 T₀代转基因阳性植株的检测
• 小结
• 参考文献
• 发表论文
• 专利申请
• 致谢