论文题目: 拟南芥1，3，4-三磷酸肌醇5/6-激酶在光形态建成中的功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 秦治翔
导师: 王学臣
关键词: 拟南芥,信号体,三磷酸肌醇,激酶,蛋白激酶,红光
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶(简称5/6-激酶)是磷酸肌醇代谢过程中的一种重要的调控酶。动物细胞中,它具有肌醇激酶和蛋白激酶双重活性,还能进行自身磷酸化,是一个从植物到人甚至线虫都保守的酶;而且5/6-激酶还是第一个鉴定出的与COP9信号体(简称CSN)互作的蛋白激酶,但它们互作的生物学意义还不清楚。植物细胞中,仅知道5/6-激酶是一种广泛存在的肌醇激酶,有关它的功能没有更多的报道。因此,研究5/6-激酶是否具有蛋白激酶的活性、是否与CSN互作,并参与植物的光形态建成,对揭示5/6-激酶的生物学功能,阐明植物光形态建成机理等方面具有重要的理论意义。 本文以拟南芥为材料,克隆了5/6-激酶的基因(命名为AtItpk-1),并进行了原核表达(His标签),纯化融合蛋白并制备了多克隆抗体。通过对AtItpk-1在不同光质下的表达分析,发现它受红光强诱导,说明AtItpk-1可能参与了植物对红光的应答。通过对AtItpk-1在拟南芥中的定位研究,发现AtItpk-1定位在细胞核中。 为了研究5/6-激酶在拟南芥中的生物学意义,对AtItpk-1的T-DNA插入突变体atitpk-1-1和atitpk-1-2进行了筛选和鉴定,并通过转基因技术获得了超表达AtItpk-1基因的转基因植株。表型分析表明,与野生型相比,atitpk-1突变体表现为红光抑制下胚轴伸长,超表达植株则表现为红光促进下胚轴伸长。另外,当将AtItpk-1基因转到突变体atitpk-1-1中,下胚轴伸长便恢复到与野生型一样。这些结果表明拟南芥5/6-激酶AtItpk-1可能参与了红光下的光形态建成。 利用我们制备的有活性的GST-AtItpk-1融合蛋白,进行了自身磷酸化实验,发现AtItpk-1具有蛋白激酶的活性。这为进一步解释5/6-激酶在光形态建成中的可能作用提供了线索。 以fus6/CSN1-3-4为材料,利用AtItpk-1的抗体和CSN4、CSN5的抗体,进行了5/6-激酶和CSN的免疫共沉淀实验,结果发现拟南芥的5/6-激酶可以和CSN共沉淀。基于免疫共沉淀和AtItpk-1、CSN都是核蛋白的结果,我们认为在拟南芥中存在5/6-激酶和CSN互作的可能性。 本研究发现了拟南芥的5/6-激酶参与了红光下的光形态建成,这一作用可能是通过与CSN互作完成的,并且5/6-激酶在光形态建成中的功能可能是通过它的蛋白激酶活性来实现的。但是,植物的光形态建成是一个非常复杂的过程,5/6-激酶参与光形态建成的具体机制仍需要进一步探讨。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 磷酸肌醇激酶的研究进展
1.1.1 1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶
1.1.2 1,3,4-三磷酸肌醇5／6—激酶
1.2 植物光受体的研究进展
1.2.1 光敏色素
1.2.2 隐花色素
1.2.3 紫外光-B受体介导的紫外光-B反应
1.3 COP／DET／FUS蛋白及COP9信号体的研究进展
1.3.1 COP／DET／FUS蛋白的研究进展
1.3.2 COP9信号体的研究进展
1.4 与COP9信号体互作的蛋白激酶的研究进展
1.5 总结
1.6 本课题的研究意义
第二章 拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5／6-激酶基因AtItpk-1的表达特性和亚细胞定位研究
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 常用培养基和溶液的配制
2.1.3 试剂配制
2.1.4 实验方法
2.2 结果与分析
2.2.1 拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5／6-激酶基因AtItpk-1的克隆
2.2.2 融合的His-AtItpk-1蛋白的诱导表达及纯化
2.2.3 AtItpk-1多克隆抗体的纯化及检测
2.2.4 AtItpk-1在不同光质下的表达分析
2.2.5 AtItpk-1蛋白的器官表达模式检测
2.2.6 AtItpk-1—GFP融合蛋白在拟南芥保卫细胞中的定位
2.3 讨论
2.3.1 AtItpk-1基因的表达受红光强诱导，暗示它可能参与了植物对红光的应答
2.3.2 AtItpk-1蛋白是一个广泛存在于拟南芥各个器官中的遍在蛋白
2.3.3 AtItpk-1蛋白是一个核蛋白
第三章 AtItpk-1的突变体及超表达植株的表型鉴定及互补分析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料
3.1.2 质粒载体
3.1.3 实验所需试剂配制
3.1.4 实验方法
3.2 结果与分析
3.2.1 突变体插入位点的分析
3.2.2 纯合突变体的筛选
3.2.3 超表达植株的筛选
3.2.4 突变体和超表达植株RNA水平和蛋白水平的检测
3.2.5 表型分析
3.2.6 互补实验
3.3 讨论
第四章 AtItpk-1的自身磷酸化活性分析
4.1 材料与方法
4.1.1 质粒载体
4.1.2 实验所需试剂配制
4.1.3 实验方法
4.2 结果与分析
4.2.1 AtItpk-1的氨基酸序列分析
4.2.2 GST与GST-AtItpk-1融合蛋白的自身磷酸化分析
4.3 讨论
第五章 AtItpk-1与COP9信号体的免疫共沉淀分析
5.1 材料与方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验所需试剂及配制(免疫共沉淀)
5.1.3 实验方法
5.2 结果与分析
5.2.1 fus6／CSN1-3-4材料的鉴定
5.2.2 AtItpk-1与CSN的免疫共沉淀(co-IP)
5.3 讨论
5.3.1 拟南芥的5／6-激酶可能和CSN互作
5.3.2 拟南芥的5／6-激酶可能通过与CSN互作来参与红光下的光形态建成
结论
参考文献
致谢
作者简历
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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