EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达的研究

论文摘要

毛囊是哺乳动物特有的一种结构复杂的皮肤附属器官,是一个富含干细胞,由神经外胚层和中胚层交互作用形成的系统。一生不断经历生长期、退行期和休止期的周期性循环。毛乳头对诱导和维持毛囊的周期性循环必不可少,其大小决定了毛囊的大小和生长期的长短。毛乳头细胞具有确定和维持毛母质细胞增殖分化的作用,而毛球部毛母质细胞的增殖分化是毛囊周期性生长调控的关键。与其他组织器官的再生一样,上皮细胞与相应间质细胞间的相互作用在毛囊的周期性生长调控中具有重要意义。绿茶是一种全世界受到广泛欢迎的饮料,EGCG是绿茶茶多酚的主要活性成分之一,具有广泛的生物学活性,已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗肿瘤及对紫外线辐射的光保护等作用。但EGCG对毛发生长及毛乳头细胞增殖的影响国内还未见报道。低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）是1992年由Semenza在Hep3B细胞株中发现的一种DNA结合蛋白,可调控多种基因的表达。其中HIF-1α是专一调节O2的HIF-1亚单位,决定了HIF-1的活性,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列低氧适应反应。现已证实HIF有调节红细胞生成、铁代谢、血管形成和葡萄糖代谢等多种作用,同时随着对HIF-1α研究的进展,发现其与细胞生长的各种应答机制有密切的关系。由于毛囊生长的关键部位（毛球部）深埋于真皮深层,皮肤表面的局部用药很难渗透到毛球部,而成纤维细胞紧邻表皮下方,并包裹在毛囊周围。我们研究小组前面的研究中已经做到将目的基因HIF-1α通过脂质体直接导入成纤维细胞,导入后在毛囊周围的成纤维细胞表达和分泌某些关键因子,如VEGF,FGF等,从而发挥促毛发生长的作用,达到治疗毛发疾病的目的。作为该课题的一部分,本实验证明了HIF-1α在毛囊和培养的毛乳头细胞中的表达,进一步为研究HIF-1α促进毛发生长的机理提供了理论依据。本课题的研究主要包括以下两部分:（一）EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响显微分离人毛囊,在加入不同质量浓度EGCG（0～250 mg/L）的Williams E培养基中培养,观察毛囊生长情况;利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,加入不同质量浓度的EGCG（0～500 mg/L）,48 h后,利用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果显示与空白对照组比较,0.1,1 mg/L的EGCG对体外培养的毛囊生长有明显促进作用（P＜0.05）;MTT显示15.6,31.2,62.5 mg/L的EGCG能够明显促进毛乳头细胞的增殖（P＜0.05）;流式细胞仪检测7.8,15.6,31.2和62.5 mg/L的EGCG作用48 h后,S期和G2/M期细胞比率明显增加,G0/G1期细胞比率明显减少,细胞增殖指数明显增加（由5.25%增至5.64%,14.61%,32.51%,37.35%）,细胞增殖指数与EGCG浓度呈显著正相关（r=0.933）。因此,我们得出结论一定浓度的EGCG能够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖。（二）HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达分离完整的人生长期毛囊,提取总RNA,RT-PCR法检测HIF-1αmRNA的表达。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,取第三代毛乳头细胞,分为正常培养组和200μM氯化钴处理组。提取总RNA,RT-PCR法检测HIF-1αmRNA的表达;提取细胞总蛋白,用Western blot法检测人毛乳头细胞中HIF-1α蛋白的表达;用免疫荧光法进一步检测人毛乳头细胞中HIF-1α蛋白的表达并定位。RT-PCR显示人毛囊及分离培养人毛乳头细胞均表达HIF-1αmRNA。Western blot显示200μM氯化钴处理的人毛乳头细胞表达HIF-1α蛋白,正常培养组未能检测到HIF-1α蛋白。免疫荧光显示200μM氯化钴处理的人毛乳头细胞胞浆、胞核中均有HIF-1α蛋白的表达,正常培养组未能检测到HIF-1α蛋白。因此我们可以得出结论人毛囊和毛乳头细胞均可表达缺氧诱导因子,但常氧下HIF-1α蛋白迅速降解,故免疫荧光、Western blot检测不到。氯化钴可模拟缺氧环境,加氯化钴处理的人毛乳头细胞免疫荧光、Western blot均检测到HIF-1α的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 前言
• 第一篇:EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二篇:缺氧诱导因子-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录一:硕士在读期间发表文章
• 附录二:综述:毛干异常