Vip3A基因和EF1α启动子的克隆、载体构建及其对烟草的转化研究

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）在其营养生长期分泌的一种杀虫蛋白,称为营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins,Vips）,这种新型高毒力蛋白基因对于构建高效广谱的基因工程微生物和培育转基因抗虫植物、控制害虫抗性发展都具有重要意义,被认为是第二代抗虫基因,其中Vip3A蛋白基因研究的最为清楚。本研究利用PCR技术克隆了Vip3A基因,序列分析表明:该基因全长2370 bp,编码789个氨基酸,其序列及预测蛋白质与已知的Vip3A氨基酸的同源性均在99%以上,该基因蛋白分子量为88 KDa,为弱酸性蛋白质。对Vip3A基因核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列进行生物信息学预测发现:Vip3A基因编码的蛋白质前端具有信号肽,并且是跨膜信号,它是一种胞外分泌蛋白,Vip3A蛋白的C端有一个稳定的功能区,二级结构预测显示这个蛋白有较明显的β折叠、α螺旋和无规则卷曲。这些特殊区域可能与其功能密切相关。为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用,及考虑到外源抗虫基因在转基因植物中表达水平低的原因,本实验又利用PCR技术克隆了烟草的EF1α启动子,该启动子是一种很好的花组织高效表达启动子,经测序及序列分析:该启动子全长1115 bp,含有EF1α基因的起始的63个编码碱基序列,含有TATA-box、CAAT-box等多个保守区,高效转录作用元件5UTR Py-rich stretch;抗氧化作用元件ARE;光反应元件Box I、Sp1;乙烯反应元件ERE;热激作用元件HSE;MYB蛋白结合位点MBS等多个顺式作用元件。将克隆的Vip3A基因和EF1α启动子,以pBI121质粒为基本载体,分别成功构建了EF1α启动子驱动GUS基因的植物表达载体pBIEF,及由组成型CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α启动子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A和pBIEFVip3A。且将这些构建好的植物表达载体通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,经PCR检测,外源基因已整合到烟草基因组中,并对获得的阳性转基因植株通过GUS组织化学染色及RT-PCR进行了表达分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 转基因抗虫植物
• 1.2 营养期杀虫蛋白
• 1.2.1 Vips 的类型
• 1.2.2 Vip3A 及其杀虫活性
• 1.2.3 Vip3A 蛋白的特性
• 1.2.4 Vip3A 蛋白作用机理
• 1.2.5 Vip3A 的应用与研究展望
• 1.3 植物启动子在转基因抗虫植物中的应用
• 1.3.1 植物启动子
• 1.3.2 植物组织特异表达启动子研究
• 1.4 本文研究的目的和内容
• 1.4.1 本文研究的目的意义
• 1.4.2 本文研究的主要内容
• 1.4.3 本文研究的技术路线
• 2 VIP3A 基因的克隆及载体构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基及试剂的制备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苏云芽孢杆菌总DNA 的制备（热裂解法）
• 2.2.2 大肠杆菌JM109 感受态细胞的制备（CaC12 法）
• 2.2.3 重组质粒转化大肠杆菌
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳DNA 片段的回收
• 2.2.5 质粒DNA 的提取
• 2.2.6 苏云芽孢杆菌Vip3A 基因的PCR 扩增
• 2.2.7 Vip3A 基因的载体构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Vip3A 基因的PCR 扩增
• 2.3.2 Vip3A 基因的载体构建
• 2.3.3 测序及序列分析
• 3 EF1Α启动子的克隆与载体构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料和质粒
• 3.1.2 酶及试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 烟草基因组DNA 的提取
• 3.2.2 EF1α启动子PCR 扩增
• 3.2.3 大肠杆菌JM109 感受态细胞的制备（见2.2.2）
• 3.2.4 重组质粒转化大肠杆菌（见2.2.3）
• 3.2.5 琼脂糖凝胶电泳DNA 片段的回收（见2.2.4）
• 3.2.6 质粒DNA 的提取（见2.2.5）
• 3.2.7 EF1-α启动子的载体构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 烟草基因组DNA 的提取
• 3.3.2 EF1Α启动子PCR 扩增
• 3.3.3 EF1α启动子的载体构建
• 3.3.4 测序及启动子序列分析
• 4 烟草的遗传转化
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料及菌株
• 4.1.2 酶及试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 溶液制备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备
• 4.2.2 重组质粒转化农杆菌
• 4.2.3 叶盘法转化烟草
• 4.2.4 转基因植株的PCR 检测
• 4.2.5 GUS 染色检测
• 4.2.6 烟草总RNA 的提取
• 4.2.7 转基因烟草的RT-PCR 检测
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 植物表达载体转化农杆菌的PCR 检测
• 4.3.2 转基因烟草植株的获得
• 4.3.3 GUS 基因的表达检测
• 4.3.4 转基因植株的半定量RT-PCR 检测
• 5 讨论
• 5.1 VIP3A 基因的克隆
• 5.2 EF1Α启动子的克隆
• 5.3 植物表达载体的构建及烟草的遗传转化
• 6 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 后续实验工作及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录