吸入麻醉剂神经毒性作用的产生机制及其预处理对Ⅰ型糖尿病模型大鼠脑缺血损伤的影响

论文摘要

背景每年全世界有超过2亿人口需要手术治疗,其中大多数实施的是使用吸入麻醉剂的全麻,吸入麻醉剂已成为临床上安全、有效、不可缺少的麻醉工具。常用的吸入麻醉剂有异氟醚、七氟醚和地氟醚。具有多种优良特性的异氟醚是当今临床上广泛应用的主流吸入麻醉药。但近年研究显示,某些术后认知功能障碍的发生似乎与异氟醚有关。进一步的实验发现异氟醚存在神经毒性作用,并可导致神经元的凋亡增加,但其发生的机制目前还不清楚。为了确定氧自由基的增高是否是异氟醚神经毒性作用的发生机制之一,我们进行了第一部分的实验。此实验是在C57BL/6J小鼠上研究了氧自由基含量的增高是否是异氟醚神经毒性作用的机制之一。七氟醚是目前一种较为新型的吸入麻醉剂。与异氟醚相比较,七氟醚更接近人们所期待的理想吸入麻醉剂,与其他氟化的吸入性麻醉剂的一个显著区别是其具有较低的血/气分布系数,低于异氟醚,因而可保证快速诱导麻醉和缩短苏醒时间。大量的实验证明,吸入性麻醉剂预处理对正常大鼠的脑缺血损伤具有神经保护作用,七氟醚是研究最广泛的用于预处理的的吸入性麻醉剂。中国糖尿病患者接近1亿,糖尿病的发病率高达9.7%,糖尿病患者并发或伴发的心脑血管病是糖尿病人致死、致残的主要原因。糖尿病患者的脑梗死发病率为非糖尿病患者的2?4倍,糖尿病并发脑梗死者复发率、致残率和死亡率均明显增高。因此提前做好糖尿病脑血管病变的预防工作,无疑是延长糖尿病人生命和提高生存质量的首要任务。第二部分实验是在STZ（streptozocin,链脲佐菌素）诱导的T1DM（type 1 diabetes mellitus,Ⅰ型糖尿病）大鼠上观察了七氟醚预处理对其大脑局灶性缺血再灌注损伤有无神经保护作用。结果表明七氟醚预处理对T1DM大鼠不具有神经保护作用,这为糖尿病患者寻找其他的防治措施及以后的机制研究奠定了基础。第一部分异氟醚神经毒性作用机制的初步研究实验一异氟醚吸入对神经元形态和caspase表达的影响目的观察异氟醚能否诱导小鼠前脑细胞凋亡,即是否有神经损伤作用。方法16只5-6月龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为异氟醚组（Iso组,n=8）和对照组（Con组,n=8）。Iso组暴露于1.4%异氟醚2h,重复三次,Con组暴露于100%氧气6h又20min。异氟醚由100%氧气输送。用HE染色法观察小鼠前额皮质细胞形态改变,免疫组化法观察Caspase-3的表达。结果1.血气分析:吸入异氟醚或单纯吸氧均未引起小鼠代谢或呼吸的显著变化。2.HE（hematoxylin and eosin,苏木精和伊红）染色:Iso组部分细胞形态较Con组发生了变化,出现了细胞皱缩,核体积缩小,形态不规整,大小不一,偶见染色质呈新月形,边集于核膜。3. Caspase-3的表达:Iso组的阳性细胞数比Con组显著增加（P<0.05）。结论将小鼠暴露于1.4%异氟醚2h,重复三次,可诱导小鼠前脑细胞凋亡,即异氟醚可产生神经毒性作用。实验二异氟醚吸入后脑内氧自由基的变化及其在细胞凋亡中的作用目的测定在异氟醚诱导产生小鼠前脑细胞凋亡时的氧自由基的变化情况;以探讨其在异氟醚诱导产生细胞凋亡中的作用。方法40只5-6月龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为异氟醚组（Iso组,n=12）、对照组（Con组,n=12）、二甲基硫脲+异氟醚组（DMTU+Iso组,n=8）和二甲基硫脲组（DMTU组,n=8）。Iso组和DMTU+Iso组暴露于1.4%异氟醚2h,重复三次,Con组和DMTU组暴露于100%氧气6h又20min。其中DMTU+Iso组在首次暴露前、DMTU组在氧气暴露前各30min时腹腔注射50mg/kg的自由基清除剂DMTU。异氟醚由100%氧气输送。用SOD（superoxide dismutase,超氧化物歧化酶）MDA（malondialdehyde,丙二醛）试剂盒测定SOD的活性和MDA的含量。用免疫组化法观察小鼠前额皮质Caspase-3的表达。结果脑组织SOD的活性、MDA的含量测定:Iso组与Con组小鼠脑内SOD活性值无显著的统计学差异（P>0.05）。Iso组MDA含量明显增多,与Con组相比其差异具有显著的统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果显示DMTU+Iso组与DMTU组仅有少量的Caspase-3阳性细胞表达。结论异氟醚诱导小鼠前脑细胞凋亡时引起了氧自由基的变化,提示氧自由基可能参与了异氟醚重复暴露诱导的神经毒性作用。氧自由基清除剂部分逆转了异氟醚诱导产生的小鼠前脑细胞凋亡,表明氧自由基是异氟醚诱导小鼠产生神经毒性作用的机制之一。实验一T1DM及对照组大鼠造模目的建立合适的I型糖尿病动物模型,即T1DM大鼠模型,为后续的实验研究奠定基础。方法将90只健康的300-320 g的雄性SD大鼠随机分为两部分:一部分用STZ诱导T1DM大鼠（n=55）;另一部分做对照组（n=35）。T1DM大鼠的造模是将血糖正常的SD大鼠禁食不禁水12h后,一次性i.p.（intraperitoneally,腹腔注射）STZ（65mg/kg）溶液,之后3d、1w、2w、4w、8w时测随机血糖,择随机血糖大于16.7mM的为纳入标准[1];对照组动物的造模是与T1DM大鼠同批次并于同时间将同浓度的柠檬酸溶液于同部位注射并饲养8w而成。血糖测定采取的是用血糖仪测大鼠尾静脉血的方法。结果经检测得到48只T1DM组大鼠;35只对照组大鼠。结论采用本方法得到了合适的糖尿病模型大鼠,为后续的实验奠定了基础。实验二七氟醚预处理对T1DM大脑局灶性缺血再灌注损伤的神经保护作用目的探讨2%七氟醚预处理对T1DM大鼠有无神经保护作用。方法将T1DM组及用于对照（control）的SD大鼠随机各分为3组,分别为MCAO、Sevo+MCAO和Sevo+Sham组,每组11只。其中DM（diabetes mellitus,糖尿病）代表糖尿病大鼠、control代表血糖正常的SD大鼠,MCAO代表对实验大鼠实施MCAO（middle cerebral artery occulision,大脑中动脉阻塞）手术、Sevo代表在MCAO或假手术前24h行七氟醚预处理、Sham代表七氟醚预处理后24h行假手术。预处理中应吸入的七氟醚浓度为2%,由100%氧气输送,吸入时间是1h/d,连续5d,且每次间相隔24h;不进行预处理的大鼠直接暴露于空气中。MCAO手术后24h用Garcia评分标准测神经学评分,然后用TTC（2,3,5 - triphenyl tetrazolium chloride,2, 3, 5—氯化三苯基四氮唑）染色测脑梗死容积及用TUNEL （ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,原位末端转移酶标记技术）染色测凋亡细胞。结果神经功能学评分结果显示:DM-MCAO组和DM-Sevo+MCAO组不具有显著的统计学差异（P>0.05）、control-MCAO组和control-Sevo+MCAO组具有显著的统计学差异（P<0.05）、DM-MCAO组和control-MCAO组相比具有显著的统计学差异（P<0.05）;TTC染色及TUNEL染色的结果与之相符,略。结论2%的七氟醚,1h/d,连续5d的吸入对T1DM大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤不具有神经保护作用。小结本实验的第一部分在证实异氟醚对C57BL/6J小鼠产生神经毒性作用的基础上,揭示了ROS在异氟醚产生神经毒性作用时的作用;在第二部分中,首先用STZ诱导T1DM大鼠,然后观察七氟醚预处理对有大脑缺血损伤的T1DM大鼠的影响。1.将小鼠暴露于1.4%异氟醚2h,重复三次,可引起Caspase-3表达增加,提示其可产生神经毒性作用。2.异氟醚吸入引起前脑细胞氧自由基含量增高,氧自由基清除剂部分逆转了异氟醚诱导产生的小鼠前脑细胞凋亡,表明氧自由基是异氟醚诱导小鼠产生神经毒性作用的机制之一。3.七氟醚预处理对T1DM大鼠的大脑缺血再灌注损伤无神经保护作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献回顾
• 1 吸入性麻醉剂神经毒性作用机制的研究进展
• 2 脑缺血及预处理的研究进展
• 3 糖尿病及其动物模型制备
• 第一部分 异氟醚神经毒性作用机制的初步研究
• 前言
• 实验一 异氟醚吸入对神经元形态和CASPASE-3 表达的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 异氟醚吸入后脑内氧自由基含量的变化及其在细胞凋亡中的作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 七氟醚预处理对STZ 诱导的T1DM 大鼠大脑缺血再灌注损伤的影响
• 前言
• 实验一 T1DM 大鼠造模
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 七氟醚预处理对T1DM 大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢