论文摘要
研究背景：重型肝炎是一种病死率很高的临床危重症。在我国,重型肝炎的主要原因仍是病毒性肝炎。研究证明,高迁移率族蛋白-1（HMGB1）在重型肝炎的发生发展中起着重要的作用。核蛋白HMGB1是生命所必须物质,近年来,胞外HMGB1的促炎症作用受到越来越多的学者关注。正常情况下,HMGB1动态结合于细胞核染色质上,因此,HMGB1如何从细胞核转移到细胞外是其发挥胞外作用的关键。目前已经取得共识的是“活化免疫细胞的主动分泌”和“坏死细胞的被动漏出”两种形式。而课题组前期研究发现,肝细胞作为实质细胞,在非坏死情况下亦能释放HMGB1,但其释放过程尚不明确。本研究第一部分以业已明确的免疫细胞分泌HMGB1的过程特点为对照,探讨肝细胞分泌HMGB1的条件,旨在回答上述问题。同时,肝细胞作为实质细胞,却证实同免疫细胞一样,能分泌炎症因子HMGB1,但其分泌的HMGB1有何生物学特性尚不明确。而探讨其生物学特性的前提是分离提纯出其分泌的HMGB1蛋白。目前对天然蛋白的纯化方法,尚处于探索阶段。本研究第二部分就分离提纯分泌型HMGB1的方法和条件进行了初步探索,为进一步研究其生物学特性奠定基础。目的：（1）在课题组前期研究基础上进一步证实实体肝细胞能分泌炎症因子HMGB1; （2）探讨肝细胞（L02和HepG2）分泌HMGB1的条件,其分泌过程的特点,与免疫细胞（U937）分泌HMGB1的过程有哪些不同；（3）初步分离纯化天然分泌型HMGB1蛋白。方法：（1）体外用不同浓度LPS刺激L02细胞,收集不同作用时间点的细胞上清液用于Western blot检测HMGB1蛋白含量,收集细胞用于MTT法检测细胞存活率,以确定LPS作用的较佳作用时间点和作用浓度。（2） 400ng/mL LPS分别刺激肝细胞系（L02和HepG2）和免疫细胞系（U937）,收集（0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h）各时间点细胞用于MTT检测细胞存活率、RT-PCR检测细胞HMGB1mRNA、HE染色和DAPI染核观察细胞形态变化、荧光TUNEL和流式细胞技术检测细胞凋亡以及细胞免疫荧光观察HMGB1蛋白移位；同时收集相应上清液用于Western blot检测HMGB1蛋白水平和LDH含量检测,相应对照组加入等体积生理盐水。（3）先后用蛋白沉淀法、超滤浓缩法、层析（离子层析、凝胶过滤）等方法分离提纯细胞上清液中的分泌型HMGB1蛋白,并用Western blot、考马斯亮蓝和银染等方法进行验证。结果：（1）体外用不同浓度LPS作用于L02细胞,其上清中分泌型HMGB1的含量并非严格剂量依赖关系。当LPS作用浓度为0-400ng/ mL时,上清HMGB1蛋白含量随着LPS浓度的增加而递增,但LPS刺激浓度增加到800ng/mL时,其含量反而较400ng/mL时低。MTT结果表明细胞存活率与LPS作用浓度负相关,当LPS浓度为0-400ng/mL时,L02细胞的存活率均在95%以上。（2）终浓度为400ng/mL的LPS作用于L02、HepG2和U937细胞0-24h, MTT和LDH结果表明非坏死细胞占绝对优势,与相应对照组比较无显著性差别（P>0.05）；荧光TUNEL和流式细胞技术检测细胞凋亡,结果发现LPS作用0-20h,三组细胞均未见明显凋亡,与相应对照组比较无显著性差别（P>0.05）；HE染色和DAPI染核结果表明,LPS作用0-24h,三组细胞与相应对照组比较,在细胞形态上无明显变化。（3） Western blot结果发现LPS作用8-24h,U937细胞上清中HMGB1蛋白的含量明显高于相应对照（P<0.05）; 16-24h, HepG2和L02细胞上清中HMGB1蛋白的含量明显高于相应对照（P<0.05）；LPS作用20h三种细胞培养上清HMGB1含量达到峰值；同时比较LPS作用下同一个时间点三种细胞分泌HMGB1的量,发现U937细胞分泌量占有优势,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）RT-PCR结果发现L02和HepG2细胞于LPS作用20h和24h其HMGB1mRNA表达水平与相应对照组比较均明显升高；而U937细胞,LPS作用12h其HMGB1mRNA表达水平与相应对照组相比,即有升高,在时相上先于L02和HepG2细胞,且升高的幅度也比L02和HepG2细胞高,差别有统计学意义（P<0.05）。（5）细胞免疫荧光结果发现终浓度400ng/mL LPS作用12-24h, HepG2和L02细胞可见HMGB1蛋白移位；而U937细胞中HMGB1移位明显早于HepG2和L02细胞（P<0.05）。（6）在天然蛋白常规纯化方法中,蛋白沉淀和超滤浓缩不适合用于HMGB1蛋白的初步纯化,而序贯应用分子筛和离子交换层析可以较大程度提纯分泌型HMGB1蛋白。结论：（1）活化肝细胞在LPS刺激下能分泌晚期炎症介质HMGB1,与免疫细胞分泌HMGB1过程相比,其分泌HMGB1的时相更晚,量更少。（2）肝细胞和免疫细胞分泌HMGB1的过程与HMGB1蛋白移位有关。（3）序贯层析法是初步提纯分泌型HMGB1蛋白较合适的方法,为进一步纯化和研究分泌型HMGB1生物学活性奠定基础。