脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2的Fmoc法固相合成、纯化及活性检测

论文摘要

环磷酰氨是目前常用抗肿瘤化疗药物,对各种肿瘤的抑制作用明显,但其毒性较大,副作用显著。因此,寻找高效、无毒抗肿瘤新药是现在药学界重要的课题,具有十分重要的意义。MP-2（Myelopeptide-2）是由俄罗斯的科学家从脊髓肽混合物中分离出的一种小肽分子,它由六个氨基酸组成,能有效抑制多种移植性肿瘤的生长。retro-MP-2由组成MP-2的氨基酸按照相反的酰胺键连接顺序构成,具有类似于MP-2的抗肿瘤活性,但作为一种非体内物质,它可以克服体内环境的生物降解作用,理论上讲,药物有效时间长、药效好,MP-2及retro-MP-2很可能成为临床抗肿瘤新药,得到广泛应用。因此,对此类功能多肽进行化学合成、制备及活性研究具有重要意义。Fmoc固相法合成多肽,可以避免传统液相合成中反应时间过长、操作过程复杂等缺点,利于反应的自动化,成为多肽合成重要的发展方向。论文应用;Fmoc-OSU、氨基酸及wang树脂对固相合成所需中间产物进行制备,氨基酸衍生物纯度达到90%以上,Leu-wang resin载重达到0.40mmol.g-1,满足下一步实验需求。论文对PSSM-8多肽合成仪合成的条件进行优化,得到最佳反应条件为;树脂浸泡时间30min,临时保护基Fmoc分两次,每次7分钟进行脱除,氨基酸预活化10min,耦联时间40min,粗品得率达到82%。论文通过对不同的活化试剂、切割条件进行比较,得HBTU/DIEA/HOBT催化体系合成效率较高,切割配方TFA/DCM/EDT/H2O/Phenol=70%;20%;2.5%;5%;2.5%所得副产物少,粗品产率较高。利用HPLC技术对粗品的分离、纯化条件进行优化,通过考察流动相、pH、柱温、流速、梯度等因素的影响,确定了Waters高效液相色谱反相柱分析条件,并利用LC-MS确定了主要产物及目标峰,中低压液相色谱（MPLC）进行纯化制备,优化了制备条件,分离出的产品溶液经冷冻干燥得到白色易于保存的产品,且纯度达到95%以上,满足活性试验要求。论文进行了MP-2和retro-MP-2的体内抗肿瘤活性研究,成功建立了S180实体肿瘤模型,通过试验得出MP-2最佳剂量组为;0.25mg·kg(-10,抑瘤率达到50.4%,retro-MP-2最佳剂量组为;1mg·kg-1,抑瘤率达到49.9%,比常用阳性对照组效果略低,但合成产品不影响小鼠生长发育。论文为MP-2、retro-MP-2的PSSM-8合成及HPLC纯化优化了实验条件,并为进一步进行药效学验证提供了初探基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 脊髓肽的研究
• 1.1.1 脊髓肽的作用
• 1.1.2 脊髓肽MPS的临床应用以及兽医学应用
• 1.1.3 脊髓肽的主要成份及其作用研究
• 1.1.4 脊髓肽MP-2的作用研究
• 1.2 多肽合成的原理
• 1.2.1 固相法合成多肽的发展
• 1.2.2 固相合成法的缺点
• 1.2.3 多肽固相合成的两种方法策略
• 1.2.4 侧链的保护及功能基团的活化
• 1.2.5 反应过程的检测
• 1.2.6 多肽的酸解
• 1.2.7 合成多肽的分析鉴定
• 1.3 多肽的纯化
• 1.3.1 合成肽的鉴定及活性测定
• 1.3.2 合成肽分离纯化模式的选择
• 1.4 课题研究背景及意义
• 1.5 课题研究内容
• 第2章 实验部分
• 2.1 实验材料及仪器
• 2.2 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2的固相合成方法
• 2.2.1 Fmoc-氨基酸衍生物的制备及检验
• 2.2.2 第一个氨基酸与树脂连接实验
• 2.2.3 Fmoc标准曲线的建立方法
• 2.2.4 树脂溶胀时间的确定方法
• 2.2.5 脱保护条件的确定方法
• 2.2.6 Kasier法监测反应进度的方法
• 2.2.7 多肽合成具体步骤
• 2.3 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2纯化及制备条件优化
• 2.4 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2生物活性检测方法
• 2.4.1 S180细胞的复苏及传代
• 2.4.2 小鼠模型建立
• 2.4.3 随机分组给药
• 2.4.4 评定及计算方法
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2的固相合成结果
• 3.1.1 Fmoc氨基酸衍生物制备结果
• 3.1.2 第一个氨基酸连接实验结果
• 3.1.3 Fmoc标准曲线的建立
• 3.1.4 树脂溶胀时间的确定
• 3.1.5 脱保护时间的确定
• 3.1.6 合成产物的确定
• 3.1.7 合成条件的优化
• 3.2 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2的纯化与制备
• 3.2.1 纯化条件的优化
• 3.2.2 LC-MS分子离子峰确认
• 3.2.3 制备色谱条件的确定
• 3.2.4 制备色谱近一步放大优化
• 3.2.5 纯品冷冻干燥及HPLC检测结果
• 3.3 脊髓肽MP-2及其类似物retro-MP-2生物活性的鉴定
• 3.3.1 脊髓肽MP-2各实验组肿瘤生长情况
• 3.3.2 脊髓肽MP-2对实体瘤S180的抑制
• 3.3.3 副产物X对实体瘤的抑制效果
• 3.3.4 retro-MP-2对实体瘤S180的抑制效果
• 第4章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 攻读学位论文期间发表的学术文章
• 致谢