橡胶树内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1抗菌活性物质的初步研究

论文摘要

橡胶树病害是阻碍天然橡胶产业顺利发展的重要因素,随着人们环保意识的增强,橡胶树病害的生物防治会越来越受到人们的普遍关注。枯草芽孢杆菌Czkl是从橡胶树根木质部分离到的一株细菌,对橡胶树根病、炭疽病以及西瓜枯萎病等有良好的抑制作用。生防菌株的鉴定、特性研究以及产生的活性物质是开发生防产品的重要基础。为了明确枯草芽孢杆菌Czkl产生的活性物质,本实验建立起一套从生防菌筛选、代谢物质研究到抗菌物质分离纯化的初步体系,为研制新型微生物农药防治橡胶树病害提供理论依据。具体研究内容如下：1、采用杯碟法和生长速率法,对橡胶树枯草芽孢杆菌菌株Czkl发酵液中活性物质进行了初步探讨,结果表明：活性物质属于胞外分泌型代谢产物,存在于发酵上清液中。进一步对发酵液理化性质研究后表明,其抗菌物质表现出耐高温,不耐强酸碱,具有对紫外线,蛋白酶K和5种常见的金属离子溶液、有机溶剂不敏感的特性；采用酸沉淀后甲醇抽提的方法可提取该活性物质；发酵上清液通过茚三酮和双缩脲试剂的颜色反应,说明抗菌物质具有肽键和环状的结构,根据发酵上清液的性质研究,推测其产生的活性物质是脂肽类抗生素。2、对菌株Czkl培养条件的单因子实验结果表明,YPD培养基作为该菌株的发酵液培养基,初始pH值为7.0,以7%接种量接种,摇床培养（28℃,180 rpm） 3d, Czkl表现出对病原菌最佳的拮抗活性。3、利用脂肽类抗生素合成相关基因的4对特异性引物,对枯草芽孢杆菌Czkl基因组进行基因检测,结果表明：菌株Czk1基因组中有表面活性素（Surfactin）合成相关基因sfp,丰源素（Fengycin）合成相关基因fenB,伊枯草菌素（Iturin）合成相关基因ituD和lpa-14,从分子水平上证明枯草芽孢杆菌Czk1具有产生脂肽类抗生素的能力。4、根据酸沉淀甲醇萃取的方法对枯草芽孢杆菌Czk1产生的活性物质进行提取,得到粗提物。将粗提物经过葡聚糖凝胶Sephadex G25柱层析进行分离纯化,得到5个组分,平皿抑菌实验和孢子萌发实验显示F3组分活性最强。对5个组分进行MALDI-TOP-MS检测分析,综合分析结果推测枯草芽孢杆菌Czk1产生的脂肽可能有C13SurfactinC或C14SurfactinB、C16SurfactinC或C16SurfactinA, C16IturinB、C17IturinB、C18IturinB,C16IturinA、C17IturinA,以及C14FengycinB、C18FengycinB、C15FengycinB或C17FengycinA,可能还产生C14BacillomycinD、 C16BacillomycinD。5、室内平皿抑菌实验表明,脂肽类粗提物抑制病菌的最低浓度>0.04g/L；抑制橡胶树炭疽病菌分生孢子萌发的EC50值为3.8mg/L; 1.0g/L脂肽类粗提物对橡胶树离体、活体叶片炭疽病的发生和扩展都有一定的抑制作用,盆栽实验也表明先喷脂肽类粗提物对橡胶树白粉病防治效果达到45.6%。其抗病机制表明,脂肽类粗提物一方面会改变细胞膜或者细胞壁的通透性,从而引起原生质泄露,造成细胞断层、干瘪死亡,最终不能完成整个分化过程；另一方面,能提高橡胶树叶片内过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO和植物苯丙氨酸酶PAL的活性,增强对外界的抵御能力,或者喷施脂肽类抗菌物质占据了某一生态位点,从而达到防病的目的。可以说,枯草芽孢杆菌Czk1防病的机制是多种方式的结合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 橡胶树病害研究进展
• 1 橡胶树白粉病为害及其防治
• 2 橡胶树炭疽病为害及其防治
• 3 橡胶树根病的为害及其防治
• 4 橡胶树白粉病、炭疽病以及根病的生物防治前景
• 第二章 枯草芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用及作用机制
• 1 枯草芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用
• 2 枯草芽孢杆菌作用机制
• 2.1 营养和空间位点竞争
• 2.2 分泌拮抗物质
• 2.2.1 核糖体合成途径
• 2.2.2 诱导植物抗性
• 2.2.3 促进植物生长
• 第三章 枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌物质研究概况
• 1 脂肽类抗生素的结构特点和作用机理
• 2 脂肽类合成相关基因
• 3 脂肽类抗生素的分离纯化
• 4 基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOP-MS）技术
• 5 肽质量指纹图谱分析鉴定
• 第四章 本研究的目的和意义
• 下篇 研究内容
• 第一章 橡胶树枯草芽孢杆菌Czk1抑菌活性物质的理化性质
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌Czk1发酵液中活性物质的初步定位
• 1.2.2 Czk1发酵上清液对温度、pH值、紫外线和蛋白酶K的耐受性
• 1.2.3 Czk1发酵上清液对有机溶剂的敏感性
• 1.2.4 Czk1发酵上清液对金属离子的敏感性
• 1.2.5 Czk1发酵上清液酸沉淀后的活性检测
• 1.2.6 不同培养基、接种量、培养时间以及培养基不同PH值对拮抗活性的影响
• 1.2.7 发酵上清液颜色反应
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌Czk1发酵液中活性成分产生部位
• 2.2 发酵上清液热稳定性
• 2.3 pH耐受性
• 2.4 对蛋白酶K和紫外线敏感性
• 2.5 有机溶剂和金属离子稳定性
• 2.6 酸沉淀甲醇萃取
• 2.7 不同培养基、接种量、培养时间以及培养基不同pH值对拮抗活性的影响
• 2.7.1 不同培养基对拮抗活性的影响
• 2.7.2 不同接种量对拮抗活性的影响
• 2.7.3 不同培养时间对拮抗活性的影响
• 2.7.4 培养基不同pH值对拮抗活性的影响
• 2.8 发酵上清液颜色反应
• 3 讨论
• 第二章 枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌物质相关基因克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 引物
• 1.3 试剂盒、试剂及酶类
• 1.4 主要仪器
• 1.5、方法
• 1.5.1 细菌总DNA提取
• 1.5.2 PCR扩增
• 2 结果分析
• 2.1 细菌总DNA提取和PCR扩增结果
• 2.2 测序结果的核苷酸比对分析
• 2.3 sfp基因氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 第三章 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽类MALDI-TOF-MS分析
• 1 材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要实验器材和试剂
• 2 方法
• 2.1 脂肽类的提取制备
• 2.2 葡聚糖凝胶Sephadex G25层析纯化
• 2.3 各组分的活性检测
• 2.4 MALDI-TOF-MS分析
• 3 结果
• 3.1 原位酸水解
• 3.2 各组分对橡胶树炭疽病菌RC178的活性检测
• 3.3 MALDI-TOF-MS分析
• 4 讨论
• 第四章 脂肽类粗提物对橡胶树炭疽病的抑制及其抗性诱导作用
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 培养基
• 1.3 发酵液制备
• 1.4 脂肽类抗菌物质的提取
• 1.5 脂肽类粗提物抑菌平板实验
• 1.6 脂肽类粗提物对孢子萌发的影响
• 1.7 脂肽类抗菌物质对橡胶树炭疽病菌离体和活体叶片的防治
• 1.7.1 离体叶片防治
• 1.7.2 活体叶片防治
• 1.8 脂肽类抗菌物质对橡胶植株相关酶活性的测定
• 1.8.1 试验处理
• 1.8.2 POD的提取和测定
• 1.8.3 PPO的提取和测定
• 1.8.4 PAL的提取和测定
• 2 结果和分析
• 2.1 脂肽类抗菌物质抑菌平板实验
• 2.2 脂肽类粗提物对孢子萌发的影响
• 2.2 脂肽类抗菌物质对橡胶树炭疽病离体和活体叶片的抑制效果
• 2.3 脂肽类抗菌物质诱导橡胶树抗性作用
• 3 结论和讨论
• 第五章 脂肽类粗提物对橡胶树白粉病盆栽防治效果
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 供试药剂
• 1.3 供试病原菌
• 1.4 方法
• 1.4.1 橡胶树粉孢（Oidium heveae sternm）的单斑分离纯化
• 1.4.2 实验处理
• 1.5 数据处理
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表文章
• 致谢